張記宇，韓郁茹，時洪艷，陳建飛，張 鑫，劉建波，張燎原，馮書風，馮廷帥，季朝陽，石 達，馮 力

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室豬消化道傳染病創(chuàng)新團隊， 哈爾濱 150069)

豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)是2017年在中國廣東省首次發(fā)現(xiàn)的一種可引起仔豬感染并發(fā)病的重要病原體[1]，感染的仔豬表現(xiàn)為嘔吐，腹瀉，脫水直至死亡。5日齡以下的仔豬死亡率高達90%，育肥豬癥狀輕微，只引起輕度腹瀉，在感染后2 d可恢復健康。組織病理學分析，感染仔豬表現(xiàn)為空腸和回腸明顯的病變，腸絨毛萎縮變短，十二指腸切片僅顯示輕微的病理變化[2]。SADS-CoV的基因序列與豬場附近洞穴內(nèi)發(fā)現(xiàn)的蝙蝠冠狀病毒(HKU2-CoV)相似率高達90%以上，暗示SADS-CoV可能由蝙蝠跨種傳播給豬[1]。SADS-CoV感染仔豬的臨床癥狀與PEDV、TGEV、PDCoV感染相似，目前，只能通過實驗室檢測方法進行鑒別診斷。因此，迫切需要建立一種靈敏可靠的診斷方法鑒定SADS-CoV感染。常規(guī)PCR雖然操作簡單，但靈敏度不高。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)可以實現(xiàn)對SADS-CoV的檢測，但不能用于定量分析樣本中病毒拷貝數(shù)[3]。熒光定量PCR技術(shù)發(fā)展迅速，具有精確度高、靈敏性強、重復性好的優(yōu)點[4-5]，目前已廣泛應用于各種動物和人類病原的檢測。本研究以SADS-CoV高度保守的N基因序列作為靶標，建立SADS-CoV熒光定量PCR檢測方法，并對感染的細胞和攻毒仔豬的臨床樣品進行檢測，為SADS-CoV流行病學調(diào)查和基礎(chǔ)研究提供可靠快捷的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞

SADS-CoV由華南農(nóng)業(yè)大學馬靜云教授惠贈，PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV均由本實驗室分離鑒定并保存。臨床檢測樣品為實驗室保存的口服SADS-CoV攻毒組和SPF新生仔豬對照組的組織。IPI-2I細胞和IPEC-J2細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

RNAiso Plus(Total RNA 提取試劑)，pMD18-T載體、T4 DNA連接酶、One Step TB Green?PrimeScriptTMRT-PCR Kit II、DH5α感受態(tài)細胞、PrimeSTAR Max DNA Polymerase和DNA凝膠回收試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自杭州Axygen公司；細胞總RNA提取試劑盒購自博日公司；病毒RNA提取試劑盒和瓊脂糖購自天根生化科技有限公司；DNA Marker購自賽默飛公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的SADS-CoV的N基因的核苷酸序列(序列號：JX312064)，通過MEGA4 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 4.0)軟件比對序列，選擇一段相對保守序列的區(qū)域，利用Primer Premier 5.0軟件進行分析，設(shè)計特異性qPCR引物。上游引物序列為SADS-N-qF：5′-CCCCTAAACCGGCTCGTAA-3′，下游引物序列為SADS-N-qR：5′-CAGAATTAGGAACACGC-TTCCA-3′，引物由吉林省庫美生物工程有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

臨床組織樣品取100 mg組織用剪鑷剪碎并用液氮進行研磨，然后通過TRIzol法提取病毒RNA。細胞內(nèi)RNA利用細胞總RNA提取試劑盒提取。收集細胞上清內(nèi)RNA利用病毒RNA提取試劑盒提取。提取的RNA采用TaKaRa(中國大連)的 PrimeScriptTMⅡ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit獲得cDNA。

1.5 重組質(zhì)粒標準品的制備

以SADS-CoV的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL：2×PrimeSTAR Max DNA Polymerase為12.5 μL；上下游引物各0.5 μL；DNA模板1 μL；ddH2O 10.5 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。采用1%濃度的瓊脂凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行驗證。PCR擴增完成后驗證擴增片段大小為449 bp，將擴增后的目的片段按照凝膠回收試劑盒說明書回收，并將其克隆至pMD18-T載體，隨后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α。篩選陽性重組質(zhì)粒送庫美生物工程有限公司測序，測序正確后的重組質(zhì)粒pMD18-T-SADS-qN作為陽性質(zhì)粒標準品，測定濃度并計算其拷貝數(shù)。

1.6 熒光定量PCR方法的建立

1.6.1 熒光定量PCR反應擴增體系 經(jīng)過條件優(yōu)化確定反應體系為20 μL，上下游引物確定最佳引物濃度為10 mmol·L-1，RNA模板量為2 μL，2×One Step TB Green RT-PCR Buffer為10 μL，PrimeScript one Step Enzyme Mix為2 μL，無RNA酶水補至20 μL。反應條件：42 ℃反轉(zhuǎn)錄5 min，95 ℃變性10 s；95 ℃預變性5 s，60 ℃退火/延伸34 s，共40個循環(huán)。

1.6.2 標準曲線的建立及敏感性試驗 利用以上優(yōu)化的反應體系，使用滅菌ddH2O將質(zhì)粒標準品進行10倍倍比稀釋(3.31×107～3.31×101拷貝·μL-1)后作為模板進行實時熒光定量PCR擴增反應，反應結(jié)束后由系統(tǒng)自動繪制生成標準曲線。

1.6.3 特異性試驗 分別以SADS-CoV、PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV陽性質(zhì)粒為模板通過建立的反應體系進行實時熒光定量PCR擴增反應，同時設(shè)立陰性對照，以此來評價該方法的特異性。

1.6.4 重復性試驗 利用建立的熒光定量PCR檢測方法，以相同拷貝數(shù)質(zhì)粒標準品為模板進行組內(nèi)重復試驗；以10倍倍比稀釋好的7個梯度(3.31×107～3.31×101拷貝·μL-1)標準品為模板進行熒光定量PCR擴增，每個稀釋度重復檢測3次，進行組間重復試驗；并通過計算變異系數(shù)(CV)，分析熒光定量PCR的組內(nèi)和組間重復性。

1.7 SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2細胞后熒光定量PCR檢測

1.7.1 SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2細胞病毒生長曲線測定 當細胞密度長至90%左右時接種SADS-CoV(MOI=1)，對照組為DMEM，37 ℃感作1 h后，用DMEM洗滌細胞3次，然后加入維持液，37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。維持液為DMEM中按照2.5 μg·mL-1的量加入不含EDTA的胰酶。分別于感染后2、12、24、36、48 h收集細胞上清，按照病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA。利用已經(jīng)建立的熒光定量PCR進行病毒含量的測定。

1.7.2 不同劑量SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2細胞熒光定量PCR檢測 當細胞密度長至90%左右時，分別采用MOI為0.1和1的SADS-CoV感染細胞，對照組為DMEM，37 ℃感作1 h后，用DMEM洗滌細胞3次，然后加入維持液，37 ℃ 恒溫CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在感染后24 h收集細胞，反復凍融3次，按照細胞總RNA提取試劑盒提取RNA。利用已經(jīng)建立的熒光定量PCR進行病毒含量的測定。

1.8 仔豬攻毒組織樣品的檢測

將6頭1日齡的SPF仔豬隨機分為兩組，試驗組仔豬口服5 mL 104TCID50SADS-CoV，對照組仔豬口服5 mL DMEM，定期觀察仔豬臨床癥狀。在感染病毒后36 h出現(xiàn)急性腹瀉，采集對照組和試驗組仔豬的各個組織臟器，分別稱量100 mg各個組織，用液氮進行研磨搗碎，隨后提取各個組織的RNA，并按照優(yōu)化的反應條件進行檢測。

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1. 擴增的SADS-CoV N目的片段；2. 陰性對照M. DL2000 DNA marker; 1. PCR product of SADS-CoV N; 2. Negative control圖1 SADS-CoV N基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR product of SADS-CoV N

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒標準品的制備

以SADS-CoV的基因組為模板，利用所設(shè)計的特異性引物PCR擴增后獲得預期大小的片段(見圖1)。隨后將目的片段回收純化與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化，挑取典型單菌落提取質(zhì)粒。對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進行測序，結(jié)果顯示成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pMD18-T-SADS-qN。測其濃度為114 ng·μL-1，換算成拷貝數(shù)為3.31×1010拷貝·μL-1。

2.2 標準曲線的建立

將標準質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋后，選取其中7個稀釋度利用優(yōu)化的熒光定量PCR反應條件進行擴增，得到不同濃度模板的擴增曲線。結(jié)果顯示，該方法在3.31×101～3.31×107拷貝·μL-1模板量時，呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.997，斜率為-3.318，標準曲線方程：y=-3.318x+37.246(圖2A)。本試驗建立的qPCR對陽性重組質(zhì)粒的擴增產(chǎn)物熔解曲線顯示，在熔解溫度Tm為(80.0±0.1)℃時出現(xiàn)了唯一的特異性峰，無引物二聚體和非特異性擴增產(chǎn)物(圖2B)。

圖2 熒光定量PCR標準品標準曲線(A)與熔解曲線(B)Fig.2 Standard curve(A) and melting curve(B) of qPCR

2.3 特異性試驗

以SADS-CoV、PEDV、TGEV、PDCoV和PRRSV陽性質(zhì)粒為模板通過建立的反應體系進行實時熒光定量PCR擴增反應，結(jié)果顯示除SADS-CoV陽性對照外，其他病毒檢測結(jié)果均為陰性(圖3)。隨后將SADS-CoV擴增產(chǎn)物進行測序比對驗證，結(jié)果顯示測序結(jié)果與參考序列一致，表明該方法具有良好的特異性。

圖3 熒光定量PCR特異性試驗擴增曲線Fig.3 Amplification plot of the specificity assay

A.熒光定量PCR檢測結(jié)果(1～7. 3.31×101～3.31×107拷貝·μL-1)；B.普通PCR檢測結(jié)果(M. DNA分子質(zhì)量標準； 1～7. 3.31×107～3.31×101拷貝·μL-1)A. Result of real-time PCR(1-7. 3.31×101 -3.31×107copies·μL-1); B. Result of common PCR (M. DL2000 DNA marker; 1-7. 3.31×107～3.31×101copies·μL-1)圖4 熒光定量PCR敏感性試驗Fig.4 Sensitivity test of the qPCR

2.4 敏感性試驗

將SADS-CoV陽性標準品倍比稀釋后的樣品作為模板，同時采用上述已建立好的熒光定量PCR方法和普通PCR方法對稀釋好的模板進行靈敏性對比檢測。結(jié)果顯示，實時熒光定量PCR可檢出最低限度為3.31×101拷貝·μL-1的標準品(圖4A)，而普通PCR方法檢測的最低限度為3.31×103拷貝·μL-1的標準品(圖4B)，由此可見建立的熒光定量PCR方法的敏感性是普通PCR的100倍。

2.5 重復性試驗

采用上述建立的熒光定量PCR方法，分別做組內(nèi)重復試驗和組間重復試驗，通過統(tǒng)計學方法計算變異系數(shù)，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，組內(nèi)變異系數(shù)為0.16%～0.64%，組間變異系數(shù)為0.11%～0.72%，變異系數(shù)均小于1%，表明建立的熒光定量PCR具有良好的重復性。

表1 熒光定量PCR重復性試驗結(jié)果

2.6 SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2細胞病毒生長曲線繪制

將MOI為1的SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2細胞，分別于感染后不同時間點(hpi)收集細胞上清，提取病毒RNA，利用已建立的檢測方法繪制病毒生長曲線。結(jié)果如圖5顯示，SADS-CoV感染細胞后2 h病毒含量較低，在12～36 h病毒含量迅速增長，36 h后病毒含量變化不大維持在較高水平。

圖5 SADS-CoV在IPI-2I和IPEC-J2細胞中一步生長曲線Fig.5 The one step growth curve of SADS-CoV in IPI-2I and IPEC-J2 cellls

2.7 不同劑量SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2細胞后的熒光定量PCR檢測

將不同劑量的SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2細胞，在感染后24 h收集細胞，反復凍融3次，提取細胞總RNA，利用已建立的熒光定量PCR方法檢測病毒的含量。結(jié)果如圖6顯示，SADS-CoV的mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)劑量依賴性增加，當MOI為1時，IPI-2I和IPEC-J2細胞病毒含量分別為106.7、105.3拷貝·mL-1。表明建立的熒光定量PCR可用于細胞中病毒含量的檢測，且可得到準確的病毒拷貝數(shù)。

圖6 熒光定量PCR檢測不同MOI的SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2細胞的情況Fig.6 Infection of IPI-2I and IPEC-J2 with different MOI of SADS-CoV examined by qPCR

2.8 仔豬攻毒組織樣品的檢測

采集對照組和攻毒組仔豬的各個腸道組織進行熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示，仔豬在感染36 h后，空腸和回腸病毒含量達到104.2～104.5拷貝·g-1(圖7)。盲腸、結(jié)腸和直腸病毒含量高主要因為在糞便中含有大量的病毒，病毒隨糞便在各個腸段分布，在組織處理時未能將糞便中的病毒排除。而對照組并未檢測到病毒的存在。隨后經(jīng)測序進一步驗證，結(jié)果顯示攻毒組測序結(jié)果與參考序列一致，確定為SADS-CoVN基因序列。所建立的方法檢測組織的最低檢測度為1×102拷貝·g-1，低于最低檢測線為陰性。綜合以上，表明建立的熒光定量PCR可用于臨床樣品的檢測。

圖7 熒光定量PCR檢測不同組織中病毒RNAFig.7 Viral RNA in different tissues was detected by qRCR

3 討 論

SADS-CoV為2017年新發(fā)現(xiàn)的豬冠狀病毒，給我國廣東省養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來了巨大威脅。SADS-CoV、PEDV、TGEV、PDCoV、豬輪狀病毒(PRoV)五種病毒都可引起豬腹瀉、嘔吐，臨床癥狀相似，且存在著混合感染的現(xiàn)象，給臨床診斷帶來了很大困擾，因此亟需建立可靠的實驗室鑒別診斷方法。目前針對該病毒的檢測方法包括病毒分離、間接ELISA、普通的PCR和熒光定量RT-PCR、血清中和試驗、環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)等[2,6]。熒光定量PCR檢測方法由于其高靈敏性、高特異性，重復性好、操作簡單等優(yōu)點，目前被應用于多種病原微生物的檢測，如新型冠狀病毒[7]、HIV[8]、人和動物多種冠狀病毒[9]等。對于SADS-CoV的檢測，Wang等[3]針對SADS-CoVN基因建立了一種簡單快速的RT-LAMP檢測方法，具有較高的特異性和靈敏性，但是此方法無法對病毒的感染情況進行定量分析。Zhou等[10]針對SADS-CoVN基因設(shè)計特異性的引物和探針，建立了基于TaqMan的實時RT-PCR檢測方法。該方法過于昂貴，且需要特殊的配套儀器，用于臨床樣品檢測成本較高。本研究針對SADS-CoVN基因保守區(qū)域，設(shè)計熒光定量PCR檢測引物，經(jīng)PCR擴增后構(gòu)建該基因標準品。隨后進行熒光定量PCR條件優(yōu)化，繪制標準曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，熔解曲線峰值單一。建立的熒光定量PCR方法特異性好，只能特異性檢測出SADS-CoV，而不能檢測出PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV等其他病毒。組內(nèi)和組間的重復性變異系數(shù)均小于1%，表明建立的方法重復性好。敏感性試驗結(jié)果顯示本研究建立的熒光定量PCR檢測方法的靈敏度高于普通PCR方法100倍。而Ma等[11]針對SADS-CoV的M基因保守區(qū)域建立的RT-qPCR檢測方法的敏感性比普通PCR高10倍。表明本研究建立的熒光定量PCR方法敏感性更好。

此外，SADS-CoV可以在多種細胞系內(nèi)復制，包括人的細胞系[12]和鼠的細胞系[13]，但SADS-CoV感染仔豬主要表現(xiàn)空腸和回腸的病理變化。IPI-2I細胞為豬的回腸上皮細胞，IPEC-J2細胞為豬的空腸細胞，兩種細胞均為SADS-CoV感染的靶細胞[14]。探究SADS-CoV在靶細胞上的感染情況，需要測定病毒的生長曲線，而傳統(tǒng)生長曲線的測定主要選用TCID50或病毒蝕斑試驗測定病毒滴度，TCID50在結(jié)果判定與統(tǒng)計過程中，人為因素對結(jié)果影響較大。病毒蝕斑試驗可以有效反映樣品中病毒滴度，但對細胞要求較高，而且并非所有病毒都能形成典型的病毒蝕斑。因此，作者利用建立的方法對SADS-CoV感染的IPI-2I和IPEC-J2細胞不同時間點病毒含量進行檢測，繪制SADS-CoV在這兩種細胞的生長曲線圖。定量描述病毒生長規(guī)律的曲線為一步生長曲線，分為潛伏期、突破期和平穩(wěn)期[15]。試驗結(jié)果顯示，SADS-CoV呈“S型”曲線增長，感染后2 h病毒含量較少，12～36 h病毒呈對數(shù)增長，36 h后病毒進入穩(wěn)定期，生長速度變慢，病毒含量維持較高水平。檢測不同劑量SADS-CoV的病毒含量試驗結(jié)果顯示，同樣MOI在不同細胞上病毒拷貝數(shù)不同，當MOI為1時，IPI-2I和IPEC-J2細胞分別為106.7、105.3拷貝·mL-1。這種差異可能與病毒在不同細胞間復制動力學不同相關(guān)，還需進一步研究。本研究也對攻毒仔豬病毒在特定器官中的分布進行檢測，發(fā)現(xiàn)病毒主要在空腸和回腸內(nèi)定殖，病毒含量為104.2～104.5拷貝·g-1。本試驗結(jié)果與之前報道的結(jié)果相符[1]。

4 結(jié) 論

建立的SADS-CoV SYBR Green熒光定量PCR檢測方法特異性高、敏感性強、重復性好，不僅可用于對SADS-CoV的診斷和監(jiān)測，還能對檢測樣品進行病毒定量。為SADS-CoV的早期監(jiān)測和流行病學調(diào)查提供了有效手段，為今后開展SADS-CoV的研究奠定了良好基礎(chǔ)。