車晶晶，徐 奎，張秀玲，向光明，王 楠，王 悅，劉志國，牟玉蓮，李 奎

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

公豬繁殖能力直接影響母豬受胎率，同時也極大地影響后代仔豬與育肥豬的生長性能。睪丸作為雄性動物的主要生殖器官，其功能受“下丘腦-垂體-睪丸軸”調(diào)控，內(nèi)含間質(zhì)細胞、支持細胞、生精細胞和管周肌樣細胞[1]。睪丸支持細胞分布在睪丸生精小管基底部，與生精細胞構(gòu)成生精小管壁[2]。生精細胞在生精小管內(nèi)規(guī)律、持續(xù)地產(chǎn)生精子，精子的正常發(fā)育等生理過程均需生精細胞與周邊支持細胞的密切配合。支持細胞能夠為生精細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，促使精原干細胞分化，進而密切調(diào)控精子的發(fā)生過程[3-4]。生精細胞通過凋亡使其數(shù)量與支持細胞保持一定的比例，從而確保其能得到充分的營養(yǎng)，保持正常的生殖功能，即支持細胞的數(shù)量和功能控制著生精細胞的數(shù)量[5]。同時，支持細胞能通過調(diào)節(jié)生殖細胞的發(fā)育直接影響胚胎睪丸的形成和精子發(fā)生，從而控制著睪丸的大小和生精量[6-7]。豬睪丸(swine testis，ST)細胞是從豬胚胎(80～90日齡)睪丸組織中分離出的未成熟支持細胞，已被用于睪丸發(fā)育機制、豬病毒特征及致病性等方面的研究[8-10]。每個成熟的支持細胞只能維持一定數(shù)量的生殖細胞進行精子發(fā)生過程，且它的數(shù)量在體成熟之前就已經(jīng)確定，只有未成熟的支持細胞(ST細胞)才會增殖，因此ST細胞對精子的發(fā)生至關(guān)重要[11]。

野生型p53誘導(dǎo)磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase l)是一種絲/蘇氨酸磷酸酶，由Ppm1d(protein phosphatase，Mg2+/Mn2+depen-dent 1 delta)基因編碼[12]，位于豬的12號染色體上。Wip1蛋白序列在哺乳動物中高度保守，其中人、豬和鼠Wip1氨基酸相似度可達到84%。Wip1基因在體內(nèi)廣泛表達，是動物各種生物過程中的重要調(diào)控因子，在多個方面發(fā)揮著功能[13-15]。研究表明，Wip1可以通過調(diào)控靶分子的磷酸化，從而在細胞周期、凋亡和DNA損傷修復(fù)等方面發(fā)揮作用，其還在由應(yīng)激反應(yīng)引起的自噬和細胞凋亡過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[16-17]。最新研究發(fā)現(xiàn)，Wip1可選擇性地結(jié)合Smad4蛋白使其Thr277位點去磷酸化，從而負調(diào)控TGF-β通路，進而調(diào)控哺乳動物細胞的生長和遷移[18]。此外，多項研究表明Wip1在繁殖方面也有重要的調(diào)節(jié)功能。Choi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Wip1基因敲除的雄鼠表現(xiàn)出了生殖器官的缺陷，免疫功能下降以及細胞周期紊亂。Filipponi和Cho等[20-21]研究也表明，Wip1基因敲除可引起ATM信號通路的激活、血睪屏障完整性受損和生殖細胞的異常發(fā)育，從而導(dǎo)致雄性動物生殖能力下降。

ST細胞對睪丸功能和精子發(fā)生發(fā)揮著重要調(diào)控作用，直接影響公豬繁殖性能，但目前在豬中關(guān)于Wip1基因?qū)T細胞的研究報道較少。因此，本研究擬采用CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)獲得Wip1基因敲除的ST細胞，從而為研究Wip1基因?qū)T細胞增殖、凋亡以及對公豬繁殖能力的影響提供細胞模型。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞和載體 ST細胞購自武漢博士德生物工程有限公司，pX330-GFP和pX330-RFP為實驗室前期留存的質(zhì)粒載體，感受態(tài)細胞為實驗室保存的DH5α[22]。

1.1.2 主要試劑 細胞培養(yǎng)所需的DMEM、FBS、Pen-strep、Trypsin均購自Gibco；Basic Primary Fibroblasts Nucleofector Kit轉(zhuǎn)染試劑盒購自Lonza公司；DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、載體連接試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；KOD FX DNA Polymerase購自寶林科(北京)生物科技有限公司；Clone Smarter TOPO-Omni-Amp購自中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 豬Wip1基因敲除載體構(gòu)建

將實驗室已有的靶向編輯豬Wip1基因第一外顯子的兩條sgRNA(sgWip1-1，sgWip1-2)分別連接到pX330-GFP和pX330-RFP載體上，分別命名為pX330-GFP-Wip1-g1和pX330-RFP-Wip1-g2。具體的構(gòu)建步驟為：1)寡聚核苷酸(oligonucleotide, Oligo)合成和退火。根據(jù)sgWip1-1和sgWip1-2序列合成互補配對的Oligo并進行退火連接，連接體系為：正反鏈Oligo各1 μL，Solution I 5 μL和ddH2O 3 μL，98 ℃加熱10 min，自然冷卻至室溫。2)質(zhì)粒連接。載體骨架與退火的Oligo反應(yīng)液按如下體系連接：質(zhì)粒載體骨架1 μL，退火oligo反應(yīng)液2 μL，Solution I 7 μL，室溫反應(yīng)5 min。3)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。將連接后的產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，并選取單菌落進行測序，測序引物為sq primer(5′-TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3′)。4)挑選正確序列的菌落，進行擴大培養(yǎng)，并用無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒提取pX330-GFP-Wip1-g1和pX330-RFP-Wip1-g2質(zhì)粒，所提質(zhì)粒用于細胞轉(zhuǎn)染。

1.3 ST細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d復(fù)蘇ST細胞，用含有10% FBS、1% Pen-strep的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當細胞長到培養(yǎng)皿的80%時即可進行轉(zhuǎn)染，按照Basic Primary Fibroblasts Nucleofector Kit(Lonza)試劑盒說明書進行電轉(zhuǎn)，然后將轉(zhuǎn)染的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48 h觀察ST細胞發(fā)光情況。

1.4 篩選雙熒光陽性單克隆細胞

用PBS沖洗轉(zhuǎn)染后48 h的ST細胞，收集消化的細胞，過濾后上機分選。以未轉(zhuǎn)染的ST細胞作為空白對照，通過流式細胞儀收集GFP、RFP雙熒光陽性細胞，進行擴大培養(yǎng)。

1.5 Wip1基因片段敲除效率檢測

收集空白對照細胞、轉(zhuǎn)染48 h后未分選的細胞和部分流式富集后的細胞進行DNA提取，然后進行PCR擴增，擴增引物為Wip1-F：5′-GCGGACAAGTCCCGACATCG-3′；Wip1-R：5′-CCCCG-AGACTTCGCCTCCAG-3′。PCR反應(yīng)體系：KOD FX 0.4 μL，KOD Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，Wip1-F 0.5 μL，Wip1-R 0.5 μL，DNA 2 μL，ddH2O 2.6 μL，共20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃ 變性10 s，68 ℃退火30 s，34個循環(huán)；72 ℃ 5 min。 PCR產(chǎn)物進行電泳，并用Image J軟件進行灰度值測定，計算sgRNA編輯效率。

1.6 單克隆細胞的培養(yǎng)及基因型鑒定

將流式富集后的混池細胞進行稀釋，每個10 cm 培養(yǎng)皿接種200個細胞，然后置于培養(yǎng)箱(37 ℃， 5% CO2)中培養(yǎng)，每3 d觀察細胞形態(tài)并及時更換培養(yǎng)基。將單個細胞團進行標記，挑取單克隆細胞傳代培養(yǎng)。待細胞長至80%時，將細胞消化下來，并取少量細胞提取基因組DNA進行PCR、測序鑒定，剩余細胞傳至24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。鑒定PCR程序和體系同“1.5”，同時將PCR產(chǎn)物進行T-A克隆，選取單克隆菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Image J軟件分析電泳條帶灰度并計算敲除效率，片段敲除效率=敲除條帶灰度值/(敲除條帶灰度值+未敲除條帶灰度值)×100%；測序峰圖用SnapGene軟件進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 ST細胞的轉(zhuǎn)染效率檢測

將構(gòu)建好的pX330-GFP-Wip1-g1和pX330-RFP-Wip1-g2質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染ST細胞，48 h后在倒置熒光顯微鏡下可以觀察到部分細胞能夠同時發(fā)出紅色熒光和綠色熒光，說明pX330-GFP-Wip1-g1和pX330-RFP-Wip1-g2質(zhì)粒載體已成功轉(zhuǎn)入ST細胞(圖1)。

A. 明場下轉(zhuǎn)染后的ST細胞；B. ST細胞紅色熒光表達情況；C. ST細胞綠色熒光表達情況；D. ST細胞紅、綠色熒光的疊加圖A. ST cells after transfection under bright field; B. The expression of RFP in ST cells; C. The expression of GFP in ST cells; D. Merge of GFP and RFP in ST cells圖1 ST細胞轉(zhuǎn)染效率檢測Fig.1 Transfection efficiency in ST cells

2.2 雙熒光陽性細胞的富集和篩選

將pX330-GFP-Wip1-g1和pX330-RFP-Wip1-g2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染ST細胞，48 h后流式分選，收集紅綠雙熒光強度最高的細胞，其占總細胞量的4.85%(圖2)，用于后續(xù)敲除效率檢測以及單克隆ST細胞篩選。

A. 空白對照細胞；B. 轉(zhuǎn)染后48 h細胞；圓圈表示流式收集的雙熒光細胞A. Blank control cells; B. Cells after 48 h of transfection; The cells in the circle represent double fluorescent cells collected by flow cytometry圖2 雙熒光細胞流式分選圖Fig.2 Flow cytometry of double fluorescent cells

2.3 Wip1基因片段敲除效率檢測

收集空白對照細胞、流式富集前后的混池細胞，提取DNA進行PCR擴增。結(jié)果顯示，空白對照細胞只在351 bp處有1條帶，流式富集前的細胞和流式富集后的細胞均有2條帶(351 和313 bp處各有1條帶)，該結(jié)果表明轉(zhuǎn)染雙gRNA后，Wip1基因發(fā)生了片段敲除，用Image J軟件分析條帶灰度值，結(jié)果顯示富集后敲除效率(74.8%)為富集前(47.8%)的1.56倍(圖3)。

M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1. 空白對照細胞；2. 轉(zhuǎn)染后48 h流式富集前的細胞；3. 流式富集后的細胞M. 100 bp DNA marker; 1. Blank control ST cells; 2. The unsorted ST cells after 48 h transfection; 3. The sorted ST cells after flow cytometry圖3 Wip1基因敲除效率的檢測Fig.3 The knockout efficiency of Wip1 gene in ST cells

2.4 單克隆細胞基因型的PCR鑒定

本試驗共篩選得到30個單克隆細胞，提取DNA進行PCR鑒定。鑒定結(jié)果表明，僅有1個單克隆ST細胞沒有發(fā)生敲除，剩余細胞均發(fā)生片段敲除，Wip1基因敲除效率可達96.7%(29/30)；其中1、2、9、20、27號克隆電泳有2條帶，說明單等位基因片段敲除的有5個克隆；24個克隆電泳出現(xiàn)1條帶(313 bp處)，即雙等位基因片段敲除克隆有24個(圖4)。隨后將所有單克隆細胞的PCR產(chǎn)物進行T-A克隆后測序，測序結(jié)果表明，純合雙等位基因片段敲除的有8個，雜合雙等位基因片段敲除的有16個(圖5)，雙等位基因純合敲除效率為26.7%(8/30)。

M. DNA相對分子質(zhì)量標準；水. 陰性對照；21. 未發(fā)生敲除的單克隆細胞；1、2、9、20、27. 單等位基因片段敲除；3～8、10～19、 22～26、28～30. 雙等位基因片段敲除M. 100 bp DNA marker; H2O. Negative control; 21. Monoclonal cell without knockout; 1, 2, 9, 20, 27. Monoallelic fragment knockout; 3-8, 10-19, 22-26, 28-30. Biallelic fragment knockout圖4 單克隆細胞基因型PCR鑒定Fig.4 The genotype of monoclonal cells identified by PCR

3 討 論

基因編輯技術(shù)是對靶基因進行編輯修飾的技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)及醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域[23-24]。CRISPR/Cas9技術(shù)憑其經(jīng)濟、便捷、高效等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于挖掘基因功能、培育動植物新品系、構(gòu)建多種疾病動物模型[25-26]，同時該技術(shù)在基因治療上的可行性和有效性也被證實[27]。豬是一種重要的畜牧用物種，利用基因編輯技術(shù)可以改善豬肉品質(zhì)、增強抗病能力；同時豬在器官組織結(jié)構(gòu)、生理等方面與人類比較近似，基因編輯豬又可以用于新藥檢測、動物疾病模型制備以及作為供體用于器官移植等[28-29]。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)在豬的抗病育種中已取得了很大的研究進展。Zheng等[30]在豬中敲入UCP1基因提高其體溫調(diào)節(jié)能力；Huang等[31]在豬中定點敲入PBD-2基因，增加了PBD-2蛋白的表達，顯著提高了豬的抗菌能力；本實驗室最新研究制備的無外源標記的CD163和pAPN雙等位基因編輯豬，能夠抵抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬傳染性胃腸炎病毒，顯著降低對豬德爾塔冠狀病毒的易感性，且不影響豬正常的生長發(fā)育、生產(chǎn)和繁殖性能[32]。

紅色的堿基表示PAM序列，綠色的堿基表示gRNA序列Red bases represent the PAM sequences, green bases represent the gRNA sequences圖5 部分單克隆細胞基因型Fig.5 The genotypes of partial monoclonal cell clones

Wip1屬于PP2C蛋白磷酸酶家族，在各個組織中廣泛表達，且在睪丸組織中高表達，與雄性動物的繁殖密切相關(guān)[12]。研究表明，Wip1基因敲除小鼠表現(xiàn)出生殖器官缺陷，進而影響雄性小鼠的繁殖能力，這些異?？赡苁怯捎赪ip1缺失后，通過依賴于ATM/BRCA1蛋白的DNA甲基化使睪丸異染色質(zhì)沉默，精蛋白的表達顯著降低導(dǎo)致的[20]。本實驗室前期利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在Wip1基因敲除小鼠睪丸中篩選出多個差異表達蛋白和磷酸化蛋白，發(fā)現(xiàn)大部分蛋白主要參與細胞粘附/緊密連接、凋亡過程、炎癥反應(yīng)、精子發(fā)生、精子運動及骨架組裝與解聚等生物學(xué)過程。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Wip1基因敲除降低了Occludin，ZO-1和N-cadherin蛋白的表達，損傷了血睪屏障的完整性，進而影響正常的精子發(fā)生過程，導(dǎo)致小鼠生殖能力下降[33]。在哺乳動物中，Wnt信號通路在胚胎發(fā)生期間的組織譜系分化、胚胎干細胞體外的維護與自我更新中發(fā)揮著重要作用[34-35]。研究報道,β-catenin蛋白主要在睪丸中表達，是睪丸組織生長成熟的必需因子，機體可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路影響睪丸細胞的增殖過程[36]。Boyer等[37]在小鼠睪丸支持細胞中發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路的持續(xù)激活，β-catenin蛋白大量表達，會使生精小管惡化，生殖細胞損失和睪丸萎縮，造成男性不育。還有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt通路激活會影響支持細胞的分化或成熟，引起生殖障礙和支持細胞瘤等[38]。此外，Cho等[21]發(fā)現(xiàn)，在生殖細胞發(fā)育過程中Wip1使Nemo樣激酶去磷酸化，增強了淋巴增強因子結(jié)合因子1與β-catenin的互作；且在小鼠細胞中發(fā)現(xiàn)Wip1缺失會抑制Oct4及生殖細胞特異性標志物Nanos3、Ddx4和Dnd1的表達活性，影響生殖細胞的發(fā)育，這表明了Wip1可能通過調(diào)控Wnt信號通路的活性影響生殖細胞發(fā)育。還有研究發(fā)現(xiàn)，p53、MAPK、Wnt信號通路可能與精子發(fā)生或繁殖有關(guān)[39]。但在豬中，Wip1在這些通路中的具體作用機制，以及其是否通過影響ST細胞增殖進而調(diào)節(jié)睪丸功能和精子發(fā)生還不清楚。

本試驗主要利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯ST細胞中Wip1基因第一外顯子，分別構(gòu)建了2個sgRNA載體，電轉(zhuǎn)染ST細胞48 h后，利用流式細胞術(shù)收集雙熒光標記的ST細胞，并篩選單克隆細胞株。經(jīng)流式富集后的敲除效率是富集前的1.56倍， 極大的提高了篩選效率，這種富集方法對其它細胞的富集也有重要參考意義。測序結(jié)果表明，Wip1基因發(fā)生片段缺失的效率可達96.7%，Wip1雙等位基因純合敲除細胞株數(shù)占總單克隆細胞株數(shù)的26.7%，這些結(jié)果表明本試驗實現(xiàn)了對Wip1基因高效的編輯。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了Wip1基因敲除的ST細胞，不僅為后續(xù)研究Wip1基因?qū)T細胞增殖、凋亡的影響提供了細胞模型，也為研究Wip1基因?qū)i繁殖性能的作用打下了基礎(chǔ)。