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        CXCR2對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、遷移及凋亡的影響

        2021-11-04 07:13:42陸偉輝王正林
        外科理論與實(shí)踐 2021年5期
        關(guān)鍵詞:趨化因子細(xì)胞系磷酸化

        陸偉輝, 劉 威, 王 聰, 王正林

        (1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院普外科,上海 201700;

        2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科,上海 200032)

        CXC類(lèi)趨化因子受體2(C-X-C motif chemokine receptor,CXCR2)是促炎趨化因子的主要受體,主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞[1-3]。其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Robinson等[4]研究顯示,CXCR2促進(jìn)腦腫瘤的生長(zhǎng)及進(jìn)展。CXCR2活化促進(jìn)乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移[5]。既往研究顯示CXCR2在胃癌組織中高表達(dá),是胃癌病人的獨(dú)立不良預(yù)后因素[6-8],但其作用機(jī)制仍不明確。本研究旨在探索CXCR2對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、遷移和凋亡的影響。

        材料與方法

        一、材料

        胎牛血清 (批號(hào):16000-044)、Trizol試劑 (批號(hào):15596-026)、Optim-MEM 培養(yǎng)基 (批號(hào):51985-034)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào):R8758)購(gòu)自Sigma公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8,批號(hào):C0038)購(gòu)自 Beyotime公司。 CXCR2 siRNA(批號(hào):AM16708)和 Lipofectamine 2000 購(gòu)自Invitrogen公司。膜聯(lián)蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào):556547)購(gòu)自BD Pharmingen公司。白細(xì)胞介素8(interleukin 8,IL-8)ELISA試劑盒(批號(hào):D8000C)購(gòu)自R&D公司。CXCR2抗體(批號(hào):ab14935)購(gòu)自Abcam公司。Transwell侵襲小室(批號(hào):3422)購(gòu)自美國(guó)Costar公司。

        二、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

        人胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC80-3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。所有細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

        三、蛋白質(zhì)印跡法

        收集細(xì)胞,用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離,恒流300 mA轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersaline,PBS)洗滌膜3次,每次5min,加入適當(dāng)比例稀釋的一抗,4℃過(guò)夜。去除洗滌液,立即加入稀釋的二抗,搖擺床上室溫培養(yǎng)2 h。結(jié)束后去除洗滌液,PBS中洗滌3次,每次10 min。取電化學(xué)發(fā)光 (electrochemilumine scence,ECL)試劑加膜上,約1 min,使用計(jì)算機(jī)自動(dòng)顯影系統(tǒng)(ImageQuant LAS 4000 mini)進(jìn)行顯影。

        四、熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

        取慢病毒感染后的胃癌細(xì)胞培養(yǎng)72 h,待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)收集細(xì)胞。用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,按說(shuō)明書(shū)操作??俁NA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm與280 nm處吸光度(A)值,A260/A280為1.9~2.1。每份樣品中取3 μg RNA行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取 1 μL cDNA行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增。CXCR2上游引物: 5′-CCTACAACCTGGTCCTGCTG-3′, 下游引物: 5′-TGAGGCAGCTGTGAAGGATG-3′;IL-8 上游引物: 5′-ACACTGCGCCAACACAGAAA-3′,下游引物:5′-AACCCTCTGCACCCAGTTT-3′;GAPDH 上游引物: 5′-CCAAAATCAAGTGGGGCGA-3′, 下游引物:5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。

        五、建立CXCR2過(guò)表達(dá)細(xì)胞系

        CXCR2過(guò)表達(dá)的慢病毒購(gòu)自吉瑪基因公司。轉(zhuǎn)染的前1天,以每孔約2×105個(gè)細(xì)胞預(yù)先將細(xì)胞接種到6孔板中;第2天,用含有聚凝胺(polybrene)的培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,加入適量的慢病毒懸液,混勻后37℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。第3天,加入新鮮培養(yǎng)基稀釋polybrene,再次37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。接著第3~4天繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況傳代,采用嘌呤霉素篩選,同時(shí)繼續(xù)傳代。篩選出帶有抗性的細(xì)胞為成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

        六、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

        CXCR2 siRNA及對(duì)照序列均購(gòu)自Invitrogen公司,采用Lipofectamine 2000試劑盒。轉(zhuǎn)染前1 d,乙二胺四乙酸 (ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)消化細(xì)胞后,將細(xì)胞加入6孔板中,轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度90%為宜。無(wú)血清、無(wú)抗體的Optim-MEM培養(yǎng)基中加入DNA 2 μg。采用該細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋4 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑,混勻后室溫放置30 min?;旌仙鲜鰞煞N溶液后,加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)孔中,輕輕搖勻后室溫放置5 min,放入37℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。第2天從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞,將培養(yǎng)基換成含血清培養(yǎng)基,保溫24~72 h后準(zhǔn)備蛋白質(zhì)印跡法表型驗(yàn)證。

        七、transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)

        將細(xì)胞接種于含人工基質(zhì)Matrigel的transwell小室中。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 24~48 h后,取出transwell小室。用棉簽擦去Matrigel膠上和上室中的細(xì)胞,使用結(jié)晶紫染色。顯微鏡觀察、拍照。同一實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件設(shè)置3個(gè)平行孔,每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)算染色細(xì)胞數(shù)。

        八、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

        EDTA消化制備細(xì)胞懸液,以每孔約5 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板。同一實(shí)驗(yàn)因素設(shè)置3個(gè)平行孔。37℃培養(yǎng),此時(shí)設(shè)置為基線(xiàn)0 h的細(xì)胞活性,給予相應(yīng)的干擾因素后培養(yǎng),相應(yīng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。每孔加入10 μL CCK8試劑,混勻后培養(yǎng)1 h。測(cè)定450 nm吸光度,結(jié)果設(shè)置為(A),對(duì)照波長(zhǎng)設(shè)置為630 nm。計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖活性=(Ax h-A空白對(duì)照)/(A0 h-A空白對(duì)照)。

        九、細(xì)胞凋亡檢測(cè)

        用EDTA消化胃癌細(xì)胞。用PBS洗滌3次懸浮細(xì)胞。PBS重新懸浮細(xì)胞1次。2 000 r/min(離心半徑9 cm)離心5 min后再次洗滌,調(diào)整細(xì)胞密度為106。取100 μL細(xì)胞懸液進(jìn)行標(biāo)記,加入5 μL的AnnexinⅤ-FITC。充分混勻后,在避光條件室溫下 15 min。流式檢測(cè)前加入5 μL的PI,上機(jī)檢測(cè)前再加200 μL緩沖液。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。根據(jù)細(xì)胞染色情況,確定活細(xì)胞為PI-/FITC AnnexinⅤ-,壞死細(xì)胞為PI+/FITC AnnexinⅤ-,早期凋亡細(xì)胞為PI-/FITC AnnexinⅤ+,晚期凋亡細(xì)胞為PI+/FITC AnnexinⅤ+。

        十、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        CXCR2上調(diào)實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組為vector,實(shí)驗(yàn)組為CXCR2;CXCR2下調(diào)實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組使用siRNA來(lái)沉默RNA表達(dá),為siCXCR2,對(duì)照組使用試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照序列,為siScr。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0軟件。組間均數(shù)比較,Student t檢驗(yàn)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        一、CXCR2促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲,提高增殖活性

        在胃癌細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或瞬時(shí)下調(diào)CXCR2的表達(dá)后(見(jiàn)圖1),檢測(cè)CXCR2的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖活力及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

        胃癌細(xì)胞上調(diào)CXCR2后 (MGC80-3細(xì)胞系見(jiàn)圖 1A、C,SGC-7901 細(xì)胞系見(jiàn)圖 1B、D),transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力較對(duì)照細(xì)胞顯著增強(qiáng) (MGC80-3 細(xì)胞見(jiàn)圖 2A、B、C,P=0.02;SGC-7901 細(xì)胞見(jiàn)圖 2D、E、F,P=0.01)。相反,筆者以小干擾RNA(siRNA)干擾細(xì)胞CXCR2的表達(dá),CXCR2蛋白表達(dá)下調(diào) (MGC80-3細(xì)胞系見(jiàn)圖1A、C,SGC-7901細(xì)胞系見(jiàn)圖1B、D)。CXCR2下調(diào)后,胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力受到顯著抑制(MGC80-3細(xì)胞見(jiàn)圖 3A、B、C,P=0.01;SGC-7901 細(xì)胞見(jiàn)圖 3D、E、F,P=0.01)。CCK8實(shí)驗(yàn)證實(shí)胃癌細(xì)胞系中CXCR2上調(diào)后增殖活性顯著增強(qiáng)(見(jiàn)圖 4 A、C,P<0.01),CXCR2 表達(dá)下調(diào)后胃癌細(xì)胞系增殖活性顯著下降(見(jiàn)圖4B、D,P<0.01)。

        圖1 胃癌細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CXCR2的構(gòu)建及采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)CXCR2表達(dá)

        圖2 胃癌細(xì)胞上調(diào)CXCR2表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響

        圖3 胃癌細(xì)胞干擾下調(diào)CXCR2表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響

        二、CXCR2過(guò)表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞凋亡

        通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞CXCR2,通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾胃癌細(xì)胞CXCR2的表達(dá),以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞在無(wú)化療藥物、無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的凋亡情況。結(jié)果顯示,上調(diào)CXCR2表達(dá)后胃癌細(xì)胞的凋亡率顯著低于對(duì)照細(xì)胞(見(jiàn)圖 4 E~H,P<0.01);下調(diào) CXCR2 表達(dá)后,細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照細(xì)胞(見(jiàn)圖4 I~L,P=0.02)。上述結(jié)果說(shuō)明,在無(wú)藥物誘導(dǎo)時(shí),胃癌細(xì)胞CXCR2的表達(dá)可抑制凋亡,維持胃癌細(xì)胞的生存。

        圖4 上調(diào)或干擾胃癌細(xì)胞CXCR2表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響

        三、胃癌CXCR2增強(qiáng)Akt磷酸化、上調(diào)Bcl-2抑制胃癌細(xì)胞凋亡

        檢測(cè)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CXCR2細(xì)胞內(nèi)Akt、Erk等與胃癌進(jìn)展密切相關(guān)分子的表達(dá)量及其磷酸化情況。結(jié)果顯示,CXCR2過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞Akt磷酸化水平顯著上調(diào),而Erk的磷酸化水平無(wú)顯著改變(見(jiàn)圖5A、C)。對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bcl-XL及存活蛋白(survivin)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Akt磷酸化水平與凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)水平一致,而B(niǎo)cl-XL和存活蛋白表達(dá)量不受CXCR2影響(見(jiàn)圖5B、D)。

        圖5 胃癌細(xì)胞CXCR2過(guò)表達(dá)抑制凋亡的機(jī)制

        討 論

        19世紀(jì),Virchow首次描述炎癥與癌癥之間的關(guān)聯(lián)[9]。多種類(lèi)型的癌癥起病過(guò)程中均有慢性炎癥參與其中,其中趨化因子在將白細(xì)胞誘導(dǎo)至炎癥和腫瘤所在部位的過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10-12]。促炎趨化因子參與慢性炎癥進(jìn)程及腫瘤微環(huán)境的形成。一個(gè)典型的例子是腫瘤部位分泌的IL-8通過(guò)趨化表達(dá)CXCR2的中性粒細(xì)胞向腫瘤部位遷移,后者參與腫瘤微環(huán)境分泌一系列生長(zhǎng)因子及基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi),促使腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[13]。

        趨化因子是細(xì)胞因子中一大類(lèi)具有化學(xué)趨化作用的蛋白質(zhì)。按照其二級(jí)結(jié)構(gòu)中的N端氨基酸殘基主要分 4大類(lèi):C、CC、CXC、CX3C類(lèi)。 C類(lèi) N端僅有1個(gè)半胱氨酸;CC類(lèi)N端不插入其他氨基酸殘基;CXC類(lèi)N端2個(gè)半胱氨酸殘基中插入1個(gè)其他氨基酸殘基;CX3C類(lèi)N端插入3個(gè)其他氨基酸殘基。趨化因子發(fā)揮多種功能,其配體主要結(jié)合相應(yīng)的受體,激活下游信號(hào)通路,發(fā)揮功能。其受體屬于G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體,根據(jù)其結(jié)合的趨化因子配體類(lèi)型進(jìn)行分類(lèi)。目前發(fā)現(xiàn)1種C類(lèi)趨化因子受體 (XCR1)、11種CC類(lèi)趨化因子受體(CCR1~11)和6種CXC類(lèi)趨化因子受體(CXCR1~6)。多項(xiàng)研究顯示,CXC類(lèi)趨化因子受體在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[14-15]。1991年,CXCR2從人中性粒細(xì)胞系克隆獲得。其與CXCR1都屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員,在氨基酸組成水平上CXCR2與CXCR1的同源度達(dá)到78%,兩者均可結(jié)合IL-8發(fā)揮生物學(xué)作用[16-17]。同時(shí)兩者的分布特點(diǎn)類(lèi)似。但兩者在生物學(xué)功能上仍存在差異。CXCR1的配體主要為IL-8及CXCL6。相比CXCR1,CXCR2 有多個(gè)配體,包括 CXCL 1~3、CXCL 5~8[18]。CXCR2的生物學(xué)功能可能更復(fù)雜。筆者既往研究發(fā)現(xiàn),CXCR2在胃癌組織中較相應(yīng)正常胃黏膜組織中過(guò)表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,CXCR2高表達(dá)與胃癌進(jìn)展呈正相關(guān),并預(yù)示病人預(yù)后差[8]。在誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞趨化參與血管形成的過(guò)程中,CXCR2是發(fā)揮介導(dǎo)作用最主要的趨化因子受體[19]。所有具有ELR基序的CXC趨化因子均可通過(guò)結(jié)合CXCR2介導(dǎo)血管形成,而血管形成是腫瘤細(xì)胞增殖的重要條件[20]。Heidemann等[3]研究發(fā)現(xiàn),CXCL8結(jié)合并激活CXCR2后,內(nèi)皮細(xì)胞的纖維聚合能力、增殖能力以及細(xì)胞內(nèi)下游信號(hào)分子ERK1/2磷酸化能力均顯著增強(qiáng)。在以CXCR2特異性抗體或ERK1/2抑制劑處理細(xì)胞后,上述增強(qiáng)作用消失。通過(guò)敲除小鼠CXCR2基因構(gòu)建的角膜微囊袋模型也證實(shí)CXCR2在血管生成過(guò)程中的重要作用[20]。胃癌病人中CXCR2的異常表達(dá)及高表達(dá)者生存預(yù)后相對(duì)較差,可能與CXCR2誘導(dǎo)腫瘤血管形成有關(guān)。因此,本研究對(duì)CXCR2在胃癌中的表達(dá)及功能進(jìn)行探索。通過(guò)穩(wěn)定上調(diào)胃癌細(xì)胞株中CXCR2的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)CXCR2高表達(dá)后胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng),而下調(diào)CXCR2后胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力被顯著抑制。

        本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CXCR2后,胃癌細(xì)胞凋亡顯著減少,而下調(diào)CXCR2后胃癌細(xì)胞的凋亡明顯增強(qiáng)。既往研究發(fā)現(xiàn)凋亡抑制蛋白Bcl-2在胃癌發(fā)生中起著重要作用[21]。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)CXCR2抑制胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制在于CXCR2使細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化水平升高,繼而使抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)上調(diào)。研究顯示,在卵巢癌中CXCR2通過(guò)抑制p53的磷酸化激活Bcl-XL及Bcl-2,從而抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn)CXCR2過(guò)表達(dá)是通過(guò)增強(qiáng)Akt磷酸化進(jìn)而激活Bcl-2高表達(dá)從而抑制凋亡。這可能與不同腫瘤、不同細(xì)胞系有關(guān)。

        本研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)CXCR2表達(dá)增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和抗凋亡能力。胃癌細(xì)胞中CXCR2的抗凋亡能力與CXCR2/Akt/Bcl-2通路相關(guān)。

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