周華書

(周寧縣水產(chǎn)技術(shù)站，福建 寧德 355400)

腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)是一種革蘭氏陽性、凝固酶陰性、非溶血性球菌[1-2]。腐生葡萄球菌廣泛存在于自然環(huán)境中，目前已報道該菌株可從女性生殖道、奶牛、腌肉制品、人胃腸道等中被分離鑒定。近年來，腐生葡萄球菌已成為動物源感染的常見病原菌[3-4]，隨著抗生素的大量使用甚至濫用，導致腐生葡萄球菌具有多重耐藥的趨勢[5]。但關(guān)于從鱘魚病料中分離到腐生葡萄球菌的研究卻鮮有報道。另外，腐敗葡萄球菌作為水產(chǎn)品的特定腐敗菌[6]，能夠迅速繁殖并產(chǎn)生具有腐敗臭味代謝產(chǎn)物的菌群[7]，極大地影響了水產(chǎn)品的品質(zhì)、貯藏貨架期。細菌全基因組測序及生物信息學的快速發(fā)展，為研究腐生葡萄球菌的進化關(guān)系提供了分子水平的依據(jù)，并在葡萄球菌耐藥性及致病因子、相關(guān)疫情暴發(fā)的檢測和鑒定等方面均具有重要意義[8]。

2021年3月周寧縣某史氏鱘養(yǎng)殖場的史氏鱘(Acipenserschrenckii)出現(xiàn)腐皮、潰瘍等癥狀，而且有死亡病例。本研究從史氏鱘潰瘍病灶處分離到1株革蘭氏陽性菌，通過形態(tài)學特征、生理生化特征、16S rRNA基因序列及系統(tǒng)進化樹對該菌株進行鑒定，研究了其耐藥特性，旨在為該菌的后續(xù)研究提供指導，為該菌可能引起的疾病防治提供科學資料。同時采用高通量測序平臺從全基因組序列層面分析菌株JY08的進化地位、毒力因子和耐藥基因，為進一步評估該菌株基因組特征提供科學數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源和主要試劑

發(fā)病的史氏鱘來源于福建省周寧縣某史氏鱘養(yǎng)殖場，體質(zhì)量為550～700 g，體長為55 cm左右。將病料放入白色的搪瓷盤中，可見腐皮及皮膚潰瘍等癥狀。

腦心浸液(BectoTMBrain heart infusion,BHI)購自BD公司；TSB、LB液體培養(yǎng)基，哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(5%脫脂綿羊血)購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。API 全自動細菌鑒定儀(型號：VITEK 2 COMPACT 30)及相關(guān)試劑購自法國梅里埃公司。細菌基因組DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶購自生工生物工程(上海)股份有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。試驗中所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 菌株的分離和培養(yǎng)

選取具有腐皮的典型癥狀史氏鱘病例，用75%的酒精對病魚進行體表消毒，無菌取其腹部潰瘍組織經(jīng)勻漿粉碎后涂布于BHI、TSB、LB瓊脂培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察生長的菌落，并挑取平板上形態(tài)顏色一致的菌落，在相同條件下進一步劃線純化培養(yǎng)，最后轉(zhuǎn)移到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，于16%的甘油中(-80℃)保存待用，菌株編號為JY08。

1.3 形態(tài)學觀察和生理生化特征試驗

將菌株JY08接種于TSA瓊脂培養(yǎng)基平板及哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(5%脫脂綿羊血)平板，30℃培養(yǎng)18 h后觀察菌落的大小、形態(tài)、顏色及溶血現(xiàn)象等，利用透射電子顯微鏡觀察其超微形態(tài)結(jié)構(gòu)。挑取BHI瓊脂培養(yǎng)基上的單菌落置于載玻片上，經(jīng)革蘭氏染色后，置于光學顯微鏡下觀察細菌形態(tài)。用無菌棉簽蘸取適量JY08單菌落于生理鹽水中，充分搖勻后使用濁度儀配制0.50～0.63 McF的菌懸液，將混合液加入GPN鑒定卡中，將鑒定卡放于API全自動細菌鑒定儀中培養(yǎng)，鑒定儀自動讀取生理生化鑒定結(jié)果。

1.4 抗生素敏感試驗

采用紙片擴散法(K-B法)檢測菌株JY08對30種藥敏紙片的敏感性，每種藥物設3個重復。30℃培養(yǎng)24 h后觀察，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，取抑菌圈直徑平均值，根據(jù)美國臨床實驗室標準研究所出版的藥敏試驗指南的標準判定菌株對不同藥物的敏感性。質(zhì)控菌株為大腸桿菌(ATCC25922)。

1.5 16S rRNA基因序列擴增及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株JY08基因組DNA，以此為模板利用細菌通用引物擴增16S rRNA基因序列，上游引物27F：5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′，下游引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增程序：95℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化，由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司(福州測序部)測序。

將序列提交到EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中進行16S rRNA基因序列相似性分析。從EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中提取與菌株JY08同源性較高菌株的16S rRNA基因序列，并從中選取16個與該株菌最相似菌株的16S rRNA基因序列，利用Clustal W進行比對，用MEGA7軟件包中的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，通過1 000次Bootstrap檢驗置信度。

1.6 基因組草圖測序及分析

利用瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop檢測和Qubit檢測上述菌株JY08基因組DNA的質(zhì)量，將純化的基因組DNA經(jīng)Covaris破碎儀隨機打斷成長度為350 bp小片段，經(jīng)末端修復和加A尾后在片段兩端連接接頭制備 DNA文庫。

庫檢合格后，利用Illumina NovaSeq PE150測序平臺對菌株JY08 DNA文庫進行基因組測序。數(shù)據(jù)下機后經(jīng)過預處理后得到 clean data，使用 SOAP denovo(Version 2.04)、SPAdes、ABySS組裝軟件進行組裝，并最終使用CISA軟件進行整合；采用gapclose(Version：1.12)優(yōu)化整合組裝結(jié)果，同時過濾掉 500 bp以下(污染)的片段，從而獲得最終的組裝結(jié)果。使用GeneMarkS(Version 4.17)軟件預測編碼基因。采用毒力因子數(shù)據(jù)庫(Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，VFDB)和抗生素耐藥基因數(shù)據(jù)庫(Comprehensive Antibiotic Research Database，CARD)對菌株的基因組中所包含的毒力基因和耐藥基因進行比對。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學特征和生理生化特征

從腐皮及皮膚潰瘍等癥狀的病魚組織中分離到一株細菌，命名為JY08。該菌革蘭氏染色為陰性；在BHI、TSB和LB固體培養(yǎng)基上生長良好，在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(5%脫脂綿羊血)經(jīng)過30℃培養(yǎng)24 h后形成大小約為0.3～0.5 cm、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊、不透明、白色菌落，不產(chǎn)生溶血圈；透射電子顯微鏡觀察可見，菌株JY08約為0.5 μm的球形(圖1)。

API 全自動細菌鑒定儀鑒定結(jié)果(表1)顯示，菌株JY08為腐生葡萄球菌，檢測結(jié)果的置信度高，為98%。菌株JY08能發(fā)酵D-核糖、D-麥芽糖、D-甘露糖、蔗糖和D-海藻糖；精氨酸雙水解酶1、α-葡萄糖苷酶、焦谷氨酸芳胺酶和尿素酶試驗為陽性；能夠在6.5% NaCl培養(yǎng)基上生長。

表1 菌株JY08生理生化特征

續(xù)表1

2.2 菌株JY08藥敏試驗結(jié)果

分離菌的藥敏試驗結(jié)果顯示，菌株JY08對β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類和林可霉素類等17種抗生素具有完全耐藥性；對氨基糖苷類、喹諾酮類和氯霉素類等11種藥物敏感；對多粘菌素B和呋喃唑酮2種藥物中度敏感(表2)。

表2 菌株JY08藥物敏感結(jié)果

續(xù)表2

2.3 16Sr RNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以菌株JY08的基因組DNA為模板，利用通用引物經(jīng)PCR擴增得到16S rRNA基因產(chǎn)物，測序結(jié)果顯示該基因為1 541 bp。將該序列提交到EzBioCloud(https：//www.ezbiocloud.net/)進行序列相似性比對分析，結(jié)果顯示，菌株JY08的16S rRNA基因序列與腐生葡萄球菌腐生亞種(Staphylococcussaprophyticussubsp.saprophyticus)相似度最高，為100%?；?6S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，菌株JY08與腐生葡萄球菌腐生亞種(Staphylococcussaprophyticussubsp.saprophyticusATCC 15305)聚集到一個發(fā)育支(圖2)。進一步表明菌株JY08屬于葡萄球菌屬，與腐生葡萄球菌腐生亞種具有較近的親緣關(guān)系。

2.4 菌株JY08基因組測序結(jié)果

菌株JY08經(jīng)Illumina測序平臺進行基因組測序后，共得到1 089 M bp clean data，通過對所測序列進行組裝，最終獲得20個contig，組裝的contigs總長度為2 666 340 bp，N50為 366 095，測序平均覆蓋深度408×，基因組質(zhì)量滿足后續(xù)生物信息學分析?；蚪M鳥嘌呤-胞嘧啶(GC)含量為33.01%，對基因組編碼基因預測，注釋得到的基因總數(shù)為2 672個(圖3)。

2.5 菌株JY08耐藥基因分析

通過對染色體基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)菌株JY08攜帶了多種類型的抗生素耐藥基因，包括10大類103個抗生素耐藥基因。從表3中可知，外排泵系統(tǒng)基因數(shù)量最多，主要包括macB(8個)、patA(6個)和lmrB(5個)等71個耐藥基因。其次為介導糖肽類抗生素(萬古霉素)耐藥的vanRC/I/M/F/I等13個耐藥基因，其余為介導β-內(nèi)酰胺類、多肽類抗生素(多粘菌素)、四環(huán)素類抗生素(四環(huán)素)、喹諾酮類、磺胺類和二氨基嘧啶類等抗生素耐藥的基因。

表3 菌株JY08中耐藥基因分析結(jié)果

2.6 菌株JY08中毒力因子分析

經(jīng)VFDB數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)菌株JY08共攜帶了61種毒力因子及123個相關(guān)毒力基因，其中與細菌黏附功能相關(guān)的毒力因子有26個包含49個基因；與胞外酶相關(guān)的毒力因子有15個包含20個基因；與宿主免疫逃逸相關(guān)的毒力因子有3個包含25個基因；與分泌系統(tǒng)相關(guān)的毒力因子有7個包含10個基因；與毒素相關(guān)的毒力因子有4個包含5個基因；與鐵攝取相關(guān)的毒力因子有6個包含14個基因(表4)。

表4 菌株JY08的毒力因子檢測結(jié)果

續(xù)表4

續(xù)表4

3 討論

腐生葡萄球菌在自然界中廣泛存在，具有豐富的生物學功能。目前，已分別從羊[9]、雞肉[10]、腐敗鯧魚[11]、土壤[12]中分離鑒定出腐生葡萄球菌。劉力等[13]從白腐乳中分離出一株腐生葡萄球菌ZH910，接種至白腐乳發(fā)酵體系中，可賦予白腐乳優(yōu)良的風味并明顯加快產(chǎn)香速度。熊晶晶等[14]從舟山雙峰鹽場的鹽田中分離篩選到一株對孔雀石綠具有較強脫色能力的腐生葡萄球菌JJ-1，孔雀石綠的主要降解產(chǎn)物為4-(二甲氨基)二苯甲酮。本研究從養(yǎng)殖的史氏鱘皮膚潰瘍病灶處分離鑒定出腐生葡萄球菌菌株JY08。該菌株能發(fā)酵乳糖和D-甘露醇，不能發(fā)酵D-甘露糖，從而可以把其與向益等[9]從羊分離的腐生葡萄球菌QJ-01區(qū)分開，同時也表明菌株JY08可能具有特異的性質(zhì)。

耐藥基因在各物種間廣泛傳播，使細菌產(chǎn)生多重耐藥性，研究細菌的耐藥基因有助于理解耐藥表型與基因型的關(guān)系，并為臨床藥物的使用提供參考。有研究檢測到36株人源腐生葡萄球菌對氨基糖苷類藥物(慶大霉素等)敏感率為100%[15]，對苯唑西林、青霉素、慶大霉素耐藥[16-17]。耐藥試驗結(jié)果表明，菌株JY08對10大類抗生素中的4種具有耐藥性，但不對慶大霉素耐藥。根據(jù)多重耐藥定義，即對三種或三種以上抗菌類中的至少一種藥物產(chǎn)生獲得性耐藥，因此菌株JY08為多重耐藥菌，本研究結(jié)果與文獻[9，18]結(jié)果不一致，可能是菌株分離源不同或者與該養(yǎng)殖場對一些抗生素使用情況有關(guān)。通過全基因組測序，發(fā)現(xiàn)該菌攜帶多種類型的抗生素耐藥基因，并以外排泵基因為主，表明外排泵系統(tǒng)可能為腐生葡萄球菌JY08產(chǎn)生耐藥性的主要因素。此外，研究發(fā)現(xiàn)15個基因與糖肽類和多肽類抗生素抗性相關(guān)，但在藥敏試驗中，菌株對這兩類抗生素敏感，表明這些基因可能不完整或者沒有表達。與藥敏試驗對應，基因組中未發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素抗性基因；此外，本研究發(fā)現(xiàn)磷霉素類、夫西地酸和二氨基嘧啶類等抗生素的耐藥基因，提示在生產(chǎn)實踐過程中應避免這些藥物的使用[19]。

近年來隨著人們對于各種毒力因子的逐步了解，一些毒力因子的致病機理也逐漸被揭示出來。通過與VFDB數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)腐生葡萄球菌JY08攜帶了大量毒力因子及相關(guān)毒力基因。例如屬于免疫逃避類毒力因子的莢膜及莢膜多糖是一種廣泛存在于細菌、支原體、部分真菌等菌體表面的碳水化合物；莢膜多糖有助于菌體抵抗干燥和低溫等不利環(huán)境，并通過在菌體表面形成物理屏障阻礙宿主補體的殺傷與吞噬作用；在長期多種應激-壓力環(huán)境下，病原菌已進化出多種免疫逃避機制并促進宿主感染[19]。此外，細菌毒素類包含多種溶血素，其中溶血素毒力基因hlyA具有廣譜殺細胞作用，可作用于紅細胞、腎臟上皮細胞和免疫細胞，誘導細胞凋亡[20]。Den Reijer P M等[21]研究表明溶血素在金黃色葡萄球菌生物膜形成等致病過程中也起著重要作用，增加了金黃色葡萄球菌的危害性。編碼LPS和Fibronectin-binding protein毒力因子的基因數(shù)量較多，這些吸附類毒力因子有助于病原菌定植，形成生物膜，建立自身微生態(tài)環(huán)境。

綜上所述，本研究對從史氏鱘源分離到的菌株JY08進行了常規(guī)鑒定及生物學特性分析，確定該菌為腐生葡萄球菌。該菌株對10大類抗生素中的4種完全耐藥，為多重耐藥菌。首次通過基因組測序技術(shù)對史氏鱘源腐生葡萄球菌進行檢測，研究了其中的毒力因子及耐藥基因情況，較為全面地預測史氏鱘源腐生葡萄球菌耐藥基因、耐藥譜、毒力因子及相關(guān)毒力基因等重要致病特性。研究結(jié)果為今后詳細探究腐生葡萄球菌JY08的致病機制、流行規(guī)律和進化變異等方面提供了借鑒依據(jù)。