郭路，劉曉程，顧超，李斌

復旦大學附屬婦產科醫(yī)院婦科/上海市女性生殖內分泌相關疾病重點實驗室，上海200011

隨著女性生育時間的延遲、三孩政策的開放以及人口老齡化的加劇，卵巢功能保護越來越受到社會關注。始基卵泡消耗加速、卵泡閉鎖增多，導致卵巢儲備功能耗竭，是卵巢衰老的病理生理特征，并伴隨相應的圍絕經癥狀、組織器官退化和代謝功能紊亂，嚴重危害女性身心健康[1]。RANKL 是腫瘤壞死因子超家族成員，參與多種生理病理過程，如骨重塑、淋巴結形成、胸腺發(fā)育、孕期乳房發(fā)育等[2]。RANKL參與調控破骨細胞分化和骨代謝過程，在老年女性骨質疏松發(fā)生中起著重要作用，并且氧化應激可能是其潛在作用機制[3-4]。近年來研究發(fā)現氧化應激相關基因在始基卵泡形成、卵泡發(fā)育、成熟、閉鎖等多個環(huán)節(jié)中均發(fā)揮作用，可能對卵巢儲備功能維持和卵巢衰老發(fā)展具有重要影響[5]。研究還發(fā)現RANKL 與月經初潮和更年期發(fā)生有關[6]。RANKL-/-小鼠生育能力降低，但RANKL 基因對卵巢功能的作用目前研究較少[7-8]。因此，本研究旨在通過RANKL-/-老年小鼠評估RANKL基因對卵巢功能影響及其可能作用機制，探索卵巢功能保護靶點，以期改善女性生活質量。

1 資料與方法

1.1 實驗分組與取樣 30 周齡SPF RANKL-/-雌鼠及同周齡野生型C57 雌鼠均購于上海南方模式生物科技股份有限公司，每組5 只，在標準的實驗室條件下適應性喂養(yǎng)7 d。每天早9 時行陰道脫落細胞涂片檢查，觀察小鼠動情周期[9]。2 組鼠于喂養(yǎng)后1月處死，收集雙側卵巢及子宮，稱定質量并計算子宮指數及卵巢指數。子宮指數=子宮濕重(mg) /體重（g）×100%；卵巢指數=卵巢濕重(mg) /體質量(g) ×100%[10]。10%甲醛溶液固定卵巢24 h，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色后400 倍光鏡下觀察，分別對始基、初級、次級及閉鎖卵泡進行計數[11]。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）全血收集后4 ℃離心10 min，收集上清后，按照相應說明書測定血清抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone,AMH）、雌二醇（Estrogen,E2）濃度、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSHPx）和丙二醛(malondialdehyde,MDA) 活性。

1.3 Ki-67 免疫組化 石蠟切片預熱，梯度濃度乙醇脫蠟。95 ℃抗原修復30 min，3%雙氧水避光孵育15 min，PBS 洗3 次，室溫下封閉30 min，50 L Ki-67抗體（1:1 000，Abcam）4 ℃過夜。第2 天，50 L二抗孵育60 min，加入50 L DAB，顯微鏡下觀察。Image Pro Plus 6.0 軟件分析圖像灰度積分光密度（IOD），用單位面積光密度（平均IOD）進行統(tǒng)計分析。

1.4 TUNEL 染色 二甲苯脫蠟10 min，2 次，梯度濃度乙醇脫蠟5 min，20 g/mL 蛋白酶K 作用30 min。PBS 洗滌3 次。加入TUNEL 溶液，在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0 軟件對數據進行分析。數據符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗；若方差不齊，用非參數檢驗。＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RANKL 基因對顆粒細胞增殖及凋亡作用 顆粒細胞為卵巢功能細胞，免疫組化檢測顯示RANKL-/-組小鼠卵巢組織顆粒細胞內增值相關標記因子Ki-67 表達顯著降低，且TUNEL 染色提示RANKL-/-小鼠顆粒細胞凋亡顯著增加。見圖1～2。

圖1 RANKL-/-小鼠卵巢組織顆粒細胞Ki-67 表達

圖2 RANKL-/-小鼠卵巢組織顆粒細胞凋亡情況

2.2 RANKL 基因對小鼠卵巢功能作用RANKL-/-小鼠體質量降低、動情頻率及始基卵泡數量減少、閉鎖卵泡數量增加，血清AMH 水平降低，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。RANKL 基因對卵巢指數無明顯影響，但子宮指數顯著升高。此外，實驗發(fā)現RANKL-/-小鼠血清E2 水平顯著降低。以上結果表明RANKL基因敲除影響卵巢顆粒細胞數量及E2合成能力，但其對卵巢儲備功能作用不明顯，其影響機制仍需后續(xù)進一步研究。見圖3。

圖3 RANKL 基因對卵巢功能作用

2.3 氧化應激可能參與RANKL 基因作用顆粒細胞過程 與對照組相比，RANKL-/-小鼠血清抗氧化相關因子SOD 抑制率和GSH-Px 活性顯著降低，氧化相關因子MDA 活性顯著升高。見圖4。

圖4 RANKL-/-小鼠氧化應激水平改變

3 討論

RANKL基因主要表達于淋巴結、胸腺、T 細胞、樹突狀細胞以及卵巢等組織中，是骨保護蛋白的配體，是破骨細胞分化和活化的關鍵因子。T 細胞活化可誘導該基因的表達，導致破骨細胞生成和骨丟失的加劇，進而引發(fā)骨質疏松以及其他骨疾病[12]。研究發(fā)現RANKL基因在乳腺發(fā)育、調節(jié)激素波動和卵巢周期中起著重要作用[13]。然而，RANKL 基因對卵巢功能作用目前仍待研究，氧化應激是否參與這一過程尚不明確。

RANKL 和RANK 相互作用可誘導Ki67 和抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，在蛻膜基質細胞生長中起重要作用[14]。在本實驗中，RANKL-/-小鼠卵巢顆粒細胞Ki-67 表達降低,細胞凋亡增加，說明RANKL 基因通過影響卵巢顆粒細胞增殖與凋亡影響顆粒細胞數量。卵巢顆粒細胞是合成及分泌雌激素的重要功能細胞，顆粒細胞增殖及分化是卵泡發(fā)育的重要特征之一，與卵細胞進行交互對話，營養(yǎng)和支持卵細胞的增長發(fā)育，在卵泡的激活、選擇及排卵等過程中均具有重要作用，影響卵巢儲備功能。本實驗發(fā)現RANKL-/-小鼠雌激素合成能力顯著降低，在體質量、動情頻率、血清AMH 水平和始基卵泡數量方面有下降趨勢，閉鎖卵泡數量有增加趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義，提示RANKL 基因可以影響老年小鼠顆粒細胞雌激素合成能力，但卵巢儲備功能無顯著改變。隨著女性年齡的增加，卵巢功能逐漸衰退，主要表現為高促性腺激素及低雌激素水平，可造成骨密度降低、認知記憶功能低下、性功能障礙和心血管疾病等遠期并發(fā)癥，嚴重影響女性身心健康。RANKL 基因的基礎研究為尋找改善更年期女性生活質量靶點提供理論依據。此外，本實驗還發(fā)現RANKL-/-小鼠卵巢指數未見明顯改變，但是子宮體積增大，子宮指數顯著增加，這可能與RANKL 基因影響子宮腺體發(fā)育相關，但其具體機制尚不清楚。RANKL 主要作用于骨細胞，并且其作用機制已得到共識，近年來，越來越多的研究表明RANKL 和骨保護素的相互作用受氧化應激調節(jié)[15]。氧化應激參與卵母細胞成熟、顆粒細胞增殖和分化以及類固醇激素分泌，進而誘導卵巢功能衰竭[16]。實驗發(fā)現RANKL-/-小鼠血清SOD 抑制率和GSH-Px 活性降低，血清MDA 活性增加，提示RANKL-/-小鼠氧化應激水平升高，可能參與RANKL 基因對顆粒細胞作用過程，但目前結果尚不能提示氧化應激是其作用機制，仍需后續(xù)進一步實驗設計。

綜上所述，RANKL 基因可以通過影響顆粒細胞增殖和凋亡影響雌激素合成能力，進而誘導女性潮熱、盜汗、骨質疏松等更年期癥狀。盡管目前實驗結果未提示卵巢功能顯著改善，但這可能與實驗存在的局限性相關。首先實驗采用的是RANKL 基因敲除鼠，RANKL 基因對卵巢的作用是非特異性的，其對其他組織器官的影響可能削弱對卵巢的作用，后續(xù)應增加RANKL基因條件性敲除鼠相關研究，或者在RANKL-/-小鼠中增加RANKL 基因的補救實驗，檢測小鼠卵巢功能改變；其次，實驗采用30 周齡的老年鼠，此年齡段野生型小鼠卵巢儲備已顯著下降；此外，RANKL-/-小鼠氧化應激水平升高，氧化應激與年齡密切相關，隨著年齡的增加，氧化應激改變應該更加顯著，在后續(xù)的實驗中應進一步延長實驗小鼠的周齡。最后，RANKL 與氧化應激的關系目前已得到共識，但RANKL 是否通過氧化應激影響卵巢顆粒細胞作用及其機制還需要更深入的基礎研究。