李國湘，方業(yè)漢，吳彬

(1.定安縣人民醫(yī)院 骨科，海南 定安 571200； 2.海南省人民醫(yī)院 骨科，海南 ?？?570311)

骨肉瘤是原發(fā)于骨的惡性腫瘤，好發(fā)部位為長骨末端?；颊吣挲g多在25歲以下，而且男性患者比例高于女性[1]。肺是骨肉瘤轉移最常見的部位，且肺轉移后患者的生存率僅為30%左右[1]。目前的臨床治療措施中，除了對骨肉瘤進行手術直接切除外，化療也是重要的治療方式。臨床常用的骨肉瘤化療藥物包括順鉑和甲氨蝶呤等[2]，但化療藥物常有骨髓功能抑制、神經損傷和肝腎損傷等各種毒副作用，且容易產生藥物耐受，影響治療效果[3- 6]。因此積極探索和開發(fā)新的安全高效的治療藥物成為骨肉瘤治療的關鍵領域之一，而傳統(tǒng)中藥單體以其高效低毒的優(yōu)勢引起研究者的重視。半枝蓮堿(scutebarbatine，SBT)是來源于中藥半枝蓮的二萜類生物堿，具有抗炎和抗菌等作用[7- 8]。此外，SBT也具有較強的抗腫瘤活性，對肺癌、白血病等多種腫瘤具有明顯的抑制作用[9- 11]。但SBT對骨肉瘤是否也有抑制作用、其機制如何，目前缺乏相關研究。本研究將從細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲這4個方面入手，分析SBT對骨肉瘤細胞是否具有抑制作用，并對這種抑制作用可能的分子機制進行初步解析，以期為臨床開發(fā)更加安全有效的治療骨肉瘤的藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人骨肉瘤細胞株MG63、143B和Saos- 2購自ATCC(American Type Culture Collection)。所有細胞放置于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清(FBS，Hyclone公司)、100 U·ml-1青霉素和100 μg·ml-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)培養(yǎng)，并進行常規(guī)傳代。

1.2 主要試劑和材料

四甲基偶氮唑鹽(MTT)、蛋白提取試劑盒、細胞裂解液(RIPA)、鈉鹽(BCA)蛋白定量試劑盒、十二烷基磺酸鈉(SDS)購自重慶升博科技有限公司，結晶紫染液、牛血清白蛋白(BSA)和Horchest 33258染液購自北京索萊寶科技有限公司，Transwell小室、熒光素素酶底物、ECL顯影液、PVDF膜和基質膠購自美國Sigma公司，蛋白質印跡法實驗一抗B淋巴細胞瘤- 2基因相關啟動子(BAD)、B淋巴細胞瘤- 2基因(BCL2)、活化的半胱氨酸蛋白酶3(cleaved caspase 3)、β- 連環(huán)蛋白(β- catenin)、原癌基因(C- myc)、G1/S- 特異性周期蛋白- D1(Cyclin D1)、糖原合成酶激酶- 3β(GSK3β)、磷酸化GSK3β(p- GSK3β)、GSK3β第9位絲氨酸(Ser9)和β- 肌動蛋白(β- actin)均購自美國Abcam公司，HRP標記的二抗購自北京博奧森生物技術有限公司，脂質體LipofectAMINE2000購自Invitrogen公司。本實驗完成于延安大學醫(yī)學院實驗中心。

1.3 方法

1.3.1 MTT實驗 143B細胞按照500個·孔-1的數量接種于96孔板，待細胞貼壁后用不同濃度(10、20、30、40、50 μmol·L-1)SBT處理24 h，加入5 mg·ml-1的MTT溶液20 μl，37 ℃孵箱孵育4 h，棄上清，加入DMSO(100 μl·孔-1)，室溫避光振蕩10 min，用酶標儀測定492 nm處各孔的吸光度(OD)值，并計算細胞生長率(=SBT組OD值/對照組OD值)。

1.3.2 克隆形成實驗 143B細胞按500個·孔-1接種于6孔板，待細胞充分貼壁后用不同濃度(20、30、40 μmol·L-1)SBT處理，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，徹底棄去培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，4%多聚甲醛固定20 min，隨后進行結晶紫染色，利用Image J軟件計數克隆形成數目。

1.3.3 劃痕實驗 143B細胞接種于6孔板，培養(yǎng)至細胞融合度為95%，用200 μl槍頭在細胞層上垂直劃線，制造出寬度一致的劃痕，用不同濃度(20、30、40 μmol·L-1)SBT處理，分別在劃痕0和16 h后顯微鏡(40倍)下拍照記錄，利用Image J軟件測量劃痕寬度并計算細胞遷移率[=(0 h劃痕寬度-16 h后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%]。

1.3.4 細胞侵襲遷移實驗 將30 μl基質膠稀釋液(DMEM培養(yǎng)基將基質膠原液按1∶5的比例稀釋)均勻鋪于小室，隨后放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，使其完全凝固。在小室內加入500 μl細胞懸液(6×104個·ml-1)，用不同濃度(20、30、40 μmol·L-1)SBT處理，小室放入24孔板培養(yǎng)48 h。用結晶紫對侵襲至小室下層的細胞進行染色，顯微鏡(100倍)下拍照記錄，并計數統(tǒng)計侵襲細胞數。

1.3.5 蛋白質印跡實驗 143B細胞接種在T75(底面積75 cm2)培養(yǎng)瓶中，當細胞融合度達70%時，用不同濃度(20、30、40 μmol·L-1)SBT處理143B細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。提取總蛋白，經10% SDS- PAGE分離后，濕轉法轉移蛋白質到PVDF膜上，5% BSA封閉1 h，加入一抗，在4 ℃冰箱中孵育過夜，TBST 洗滌3次。加入HRP標記的二抗，37 ℃孵育1 h，滴加ECL顯影液并在凝膠成像系統(tǒng)中采集蛋白條帶圖像。

1.3.6 熒光素酶報告基因實驗 143B 細胞接種于T25(底面積為25 cm2)培養(yǎng)瓶中，當細胞融合度達60%時，進行TopLuc質粒(反映Wnt/β- catenin信號中TCF/LEF的轉錄活性)轉染，體系如下：5 μl Lipofectamine2000+ 3 μg TopLuc質粒+200 μl DMEM培養(yǎng)液(無FBS無雙抗)，4 h后再換成5 ml的完全DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)細胞至融合度90%，胰酶消化細胞并接種于24孔板中，細胞貼壁后用不同濃度(20、30、40 μmol·L-1)SBT處理，繼續(xù)培養(yǎng)6和12 h后，按照Promega熒光素酶檢測試劑盒提供的操作方法檢測熒光素酶活性的改變。

1.4 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0軟件，數據作圖采用Graph Pad Prism 5軟件，實驗數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 SBT抑制人骨肉瘤細胞株增殖

MTT實驗顯示：SBT可抑制人骨肉瘤癌細胞株MG63、143B和Saos- 2增殖，使細胞生長速度減慢，且呈一定濃度依賴性(圖1)。在后續(xù)實驗中選擇20、30、40 μmol·L-13個濃度的SBT進行分析。克隆形成實驗顯示：SBT可抑制143B細胞的克隆形成(圖2A)，使細胞克隆形成數減少(圖2B)。以上結果提示，SBT可抑制骨肉瘤細胞的增殖。

a P<0.05； b P<0.01

圖2 SBT對143B細胞克隆形成的影響 A. SBT對143B細胞克隆形成的影響(結晶紫染色)； B. SBT對143B細胞克隆形成的影響(克隆形成數，a P<0.01)

2.2 SBT促進143B細胞凋亡

Horchest 33258染色結果顯示：SBT可誘導143B細胞凋亡，細胞核出現(xiàn)固縮、碎裂和染色質聚集等高亮熒光現(xiàn)象(圖3A、B)。蛋白質印跡法檢測結果顯示：SBT處理后，促凋亡分子BAD蛋白水平增加，而凋亡抑制分子BCL2蛋白水平下降，細胞凋亡執(zhí)行者caspase 3的活性形式cleaved caspase 3蛋白水平增加(圖3C)。以上結果提示，SBT可促進143B細胞發(fā)生凋亡。

圖3 SBT對143B細胞凋亡的影響 A. SBT對143B細胞凋亡的影響(Horchest 33258染色×100)； B. SBT對143B細胞凋亡的影響(凋亡率，a P<0.01)； C. SBT對143B細胞凋亡相關分子的影響(蛋白質印跡法)

2.3 SBT抑制143B細胞遷移和侵襲

劃痕實驗結果顯示：SBT抑制143B細胞遷移，使劃痕愈合延遲(圖4A、B)。Transwell小室實驗結果顯示：SBT可抑制143B細胞的侵襲，使穿過小室的細胞數目減少(圖4C、D)。以上結果提示，SBT可抑制143B細胞的遷移及侵襲。

圖4 SBT對143B細胞遷移和侵襲的影響 A、B. SBT對143B細胞遷移的影響(劃痕實驗×40，a P<0.05，b P<0.01)； C、D. SBT 對143B細胞凋亡的影響(Transwell小室實驗×100，c P<0.01)

2.4 SBT抑制143B細胞中Wnt/β- catenin信號途徑的活化

為了驗證SBT參與了骨肉瘤的生長和轉移的抑制過程,我們利用熒光素酶報告基因實驗和蛋白質印跡法分析了SBT對Wnt/β- catenin信號的影響。熒光素酶報告基因實驗顯示：SBT處理后，TopLuc熒光素酶活性降低(圖5A、B)。進一步蛋白質印跡法分析證實：SBT處理后，β- catenin的蛋白水平下調，β- catenin所直接調控的下游分子C- myc及Cyclin D1的蛋白水平也相應降低(圖5C)。不僅如此，SBT還可抑制Ser9的磷酸化水平(圖5C)。以上結果提示，SBT可抑制骨肉瘤細胞Wnt/β- catenin信號活化。

圖5 SBT對143B細胞中Wnt/β- catenin信號的影響 A、B. SBT 對143B細胞中Wnt/β- catenin信號的影響(熒光素酶報告基因實驗，a P<0.01)；C.SBT處理36 h對143B細胞中Wnt/β- catenin信號的影響

3 討 論

骨肉瘤是骨骼系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其臨床常用的化療藥物毒副作用較大、易產生耐藥性，因此開發(fā)新的治療藥物有助于提高骨肉瘤的治療效果。SBT是從半枝蓮中提取的生物堿單體，具有明顯的抗腫瘤作用：SBT在體外和小鼠體內對肺癌細胞A549均具有明顯抑制作用[9]；SBT也可抑制白血病細胞K562增殖(IC50為42.73 μmol·L-1)[10]。

本研究分析了SBT對人骨肉瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。MTT實驗和克隆形成實驗提示SBT可抑制骨肉瘤細胞增殖，劃痕實驗和細胞侵襲遷移實驗表明SBT可抑制骨肉瘤細胞侵襲。caspase 3是凋亡的重要執(zhí)行者，而cleaved caspase 3則是其活性形式[12]。BAD是經典的促凋亡蛋白，而BCL2則為關鍵的抗凋亡蛋白[13]。當細胞發(fā)生凋亡時，往往可檢測到cleaved caspase 3、BAD和 BCL2的變化，并由此作為細胞發(fā)生凋亡的特征性標志。我們通過蛋白質印跡法分析發(fā)現(xiàn)，SBT可增加cleaved caspase 3和BAD的蛋白水平，降低BCL2蛋白水平，而Horchest 33258染色分析發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細胞核出現(xiàn)核碎裂、核固縮等凋亡的細胞核形態(tài)表現(xiàn)，表明SBT可促進骨肉瘤細胞發(fā)生凋亡。上述結果提示，SBT對人骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲均具有較好的抑制作用，而對骨肉瘤細胞的凋亡則具有一定的促進作用。

在骨肉瘤中常有Wnt/β- catenin 信號的持續(xù)激活[14- 15]。利用藥物抑制Wnt/β- catenin信號途徑[16- 17]，或小干擾RNA靶向抑制β- catenin表達[18]，均可相應促進骨肉瘤細胞的凋亡?；诖?，在機制研究中我們著眼于分析SBT對Wnt/β- catenin 信號的影響。首先熒光素酶報告基因顯示SBT可抑制Topluc熒光素酶活性，初步提示SBT可抑制Wnt/β- catenin 信號。蛋白質印跡法分析發(fā)現(xiàn)SBT可使骨肉瘤細胞Wnt/β- catenin信號中關鍵分子β- catenin蛋白減少，繼而使得β- catenin下游靶分子c- Myc和Cyclin D1蛋白水平降低。GSK3β是β- catenin的負向調控因子，當Ser9磷酸化后，GSK3β降解β- catenin的活性降低[19]，而我們通過蛋白質印跡法檢測發(fā)現(xiàn)SBT可抑制GSK3β的Ser9磷酸化，由此推測：SBT可通過抑制GSK3β的Ser9磷酸化，繼而促進GSK3β對β- catenin的降解，使得β- catenin水平降低，最終導致Wnt/β- catenin信號受到抑制。上述結果提示：SBT可能通過抑制骨肉瘤細胞Wnt/β- catenin信號途徑抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并促進其發(fā)生凋亡。

本研究初步證實SBT可抑制人骨肉瘤細胞增殖、遷移及侵襲而促進其凋亡。這可能與SBT抑制GSK3β的Ser9磷酸化，增強β- catenin負向調控分子GSK3β的活性，從而降低β- catenin蛋白水平，使得Wnt/β- catenin信號受到抑制有關。后續(xù)實驗將繼續(xù)探討SBT對骨肉瘤細胞中其他信號途徑如TGFβ、Hedgehog、p53、Cox2、JAK- STAT、NF- κB、MAPK和PI3K/AKT信號途徑等腫瘤相關信號途徑的影響，為深入闡明SBT抑制骨肉瘤的分子機制從而用于骨肉瘤的治療奠定基礎。