李金艷,楊根嶺，錢冠華

(1.重慶市中醫(yī)院產(chǎn)科 400021；2.重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科 400010)

胚胎肺發(fā)育于前腸腹側(cè)內(nèi)胚層周圍被間充質(zhì)細(xì)胞包圍，在發(fā)育過程中腹側(cè)變成肺上皮細(xì)胞，而間充質(zhì)細(xì)胞則變?yōu)榉螌?shí)質(zhì)。胎肺發(fā)育經(jīng)歷3個(gè)時(shí)期：腺狀期、小管期和原始肺泡形成期[1]。宮內(nèi)環(huán)境影響著胎肺發(fā)育并引起肺組織形態(tài)學(xué)改變[2]。肺組織中肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞 (alveolar epithelial type Ⅱ cells,AECⅡ)有極其重要的作用。肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 (surfactant-associated protein,SP),包括SP-A、SP-B、SP-C和SP-D。其中SP-A最為豐富，其表達(dá)水平的減少與哺乳動(dòng)物的肺疾病密切相關(guān)。

干擾胎兒肺發(fā)育的主要因素是妊娠期糖尿病(GDM)和早產(chǎn)[3]。GDM時(shí)，胎肺的發(fā)育受到影響，肺成熟延遲，肺泡表面積減少，肺泡表面活性物質(zhì)減少，肺泡血管通透性增加。GDM母親分娩的新生兒容易出現(xiàn)巨大兒、低血糖、先天畸形、高膽紅素血癥、新生兒呼吸窘迫綜合征，疾病的發(fā)病率和病死率更高[4]。而目前GDM對(duì)胎肺發(fā)育的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究GDM對(duì)胎鼠AECⅡ細(xì)胞的影響及意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)SD雌鼠30只、SD雄鼠10只，體重約250～350 g，約2月齡，于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無特定病原體(SPF)級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)涉及的操作方案均通過重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

鏈脲佐菌素、油紅O粉劑、Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma公司；安穩(wěn)免調(diào)血糖儀由三諾生物傳感公司生產(chǎn)；兔抗SP-C多克隆抗體、兔抗SP-A多克隆抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自美國Santa Cruz公司；即用型SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒、DAB顯色劑、0.25%胰蛋白酶溶液 (不含EDTA)、DMEM/F12 1∶1液體培養(yǎng)基(常規(guī)) 、DMEM/F12 1∶1液體培養(yǎng)基 (含胎牛血清、青霉素、鏈霉素)、D-Hanks緩沖液 (不含酚紅、不含鈣鎂) 購自武漢博士德公司；DnaseⅠ酶、大鼠IgG購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1動(dòng)物分組與處理

將發(fā)情的SD雌鼠雌雄3∶1比例合籠，次日8:00取雌鼠陰道分泌物，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)精子者記為妊娠第1天 (D1) 。將孕鼠分為對(duì)照組和GDM組，每組10只孕鼠。GDM組孕鼠給予1%鏈脲佐菌 (Streptozotozin,STZ) 新鮮溶液 (0.1 mol/L、pH 4.4檸檬酸緩沖液現(xiàn)配) 按40 mg/kg行腹腔注射。給藥72 h后測(cè)定尾靜脈血血糖值，血糖值大于15.0 mmol/L表明建模成功。對(duì)照組孕鼠腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。每2天檢測(cè)SD大鼠血糖及體重變化情況。孕20.5 d后剖宮產(chǎn)。

1.3.2孕鼠和胎鼠血葡萄糖的測(cè)定

采集孕鼠眼眶靜脈血，抗凝、離心后取血漿，使用葡萄糖測(cè)定試劑盒，采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定。胎鼠取腹主靜脈血，測(cè)定方法同孕鼠。

1.3.3胎鼠AECⅡ的分離純化及原代培養(yǎng)

SD孕鼠行剖宮產(chǎn)術(shù)，取出胎鼠肺組織，D-Hanks液洗滌后，將胎肺組織剪至細(xì)末，再次洗滌。加入消化液(0.25%胰蛋白酶+0.1%Ⅰ型膠原酶溶液+0.04 g/L DnaseⅠ酶溶液) ，37 ℃消化，不銹鋼網(wǎng)篩過濾，收集細(xì)胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸后，離心，棄上清液，加入0.1%Ⅰ型膠原酶溶液和0.04 g/L DnaseⅠ酶溶液，37 ℃再次消化，然后接種在大鼠IgG包被的培養(yǎng)皿中貼壁(第一次貼壁)。未貼壁的細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后換液，將貼附于培養(yǎng)皿或6孔培養(yǎng)板生長的細(xì)胞(第二次貼壁)采用免疫熒光染色方法進(jìn)行鑒定。

1.3.4臺(tái)盼藍(lán)染色

取接種的AECⅡ細(xì)胞懸液100 μL，加入培養(yǎng)基稀釋至400 μL，再加入100 μL的0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液，用血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，拒染的為活細(xì)胞，藍(lán)染的細(xì)胞為死細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞所占百分比。

1.3.5透射電鏡鑒定

分別收集培養(yǎng)皿或6孔培養(yǎng)板的AECⅡ細(xì)胞，加入2.5%戊二醛固定液，沉淀2 h，用梯度乙醇脫水，用純丙酮加包埋液(1∶2) 包埋，37 ℃烘箱內(nèi)固化，切片機(jī)切片 (50～60 nm)，用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。HITACHI-600透射電鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.3.6蘇木素-伊紅(HE)染色

將胎鼠肺組織切片置烤箱烤至溶蠟，切片于二甲苯脫蠟；先后浸泡在100%、95%、70%梯度乙醇中；蘇木精染色，置于0.5%鹽酸乙醇數(shù)秒后取出，伊紅染色，依次在100%、95%梯度乙醇中脫水，吸干乙醇，二甲苯透明，室溫過夜，中性樹脂封片。

1.3.7油紅O染色

胎鼠肺組織冰凍切片(10 μm)，10%多聚甲醛室溫固定30 min，60%異丙醇浸洗2 min；油紅O工作液染色15 min，60%異丙醇調(diào)色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，中性樹脂封片。

1.3.8免疫熒光技術(shù)檢測(cè)

第1次貼壁和第2次貼壁細(xì)胞爬片后用4%多聚甲醛固定，并固定于載玻片上。加入含0.5% TritonX-100的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，加入一抗SP-C(1∶50稀釋) ，4 ℃孵育過夜。洗滌后加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶100稀釋)，避光37 ℃下孵育30 min。洗滌后加入DAPI染色細(xì)胞核(1∶50稀釋)，避光室溫下孵育30 min。洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.9免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)

細(xì)胞爬后片用4%多聚甲醛固定，并固定于載玻片上。加入0.5% TritonX-100，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，加入一抗SP-A (1∶50稀釋)，4 ℃過夜。洗滌后加入辣可忍受過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶100稀釋)，37 ℃下孵育30 min。DAB顯色后，經(jīng)復(fù)染、分化、脫水、封片后在顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物模型建立成功

對(duì)照組、GDM組、GDM組胎鼠、GDM組胎鼠血糖分別為(4.68±0.45)、(21.68±3.51)、(4.26±0.51)、(17.49±2.63)mmol/L，GDM組及GDM組胎鼠血糖較相應(yīng)的對(duì)照組顯著升高(P=0.001)，妊娠期尿病大鼠模型成功建立。

2.2 原代培養(yǎng)胎鼠AECⅡ及鑒定

2.2.1原代培養(yǎng)的胎鼠AECⅡ形態(tài)及純度檢測(cè)

AECⅡ形態(tài)為多邊形或立方形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有較多粗大黑色顆粒，細(xì)胞核大，部分細(xì)胞核為雙核。細(xì)胞開始生長呈島狀分布，后細(xì)胞融合為片狀生長 (圖1A) 。每6只20.5 d胎齡的胎鼠肺組織可獲得 (15±3)×106個(gè)AECⅡ細(xì)胞。通過臺(tái)盼藍(lán)染色方法檢測(cè)到接種細(xì)胞活力為(95±3)%，細(xì)胞的純度為(98±2)%。透射電鏡觀察原代培養(yǎng)的AECⅡ細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見到同心圓狀、多層的板層小體，板層小體為黑色，在細(xì)胞膜上可見較多微絨毛(圖1B)。

A：AECⅡ細(xì)胞普通光鏡下形態(tài)(×400)；B：AECⅡ細(xì)胞透射電鏡下形態(tài)(×8 000)。

2.2.2免疫熒光檢測(cè)SP-C在原代培養(yǎng)的AECⅡ中的表達(dá)

因SP-C蛋白在AECⅡ細(xì)胞中為特異性表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞表達(dá)SP-C時(shí)，可確定該細(xì)胞即為AECⅡ。第1次貼壁細(xì)胞未見綠色的熒光(圖2A)，細(xì)胞核見藍(lán)色熒光 (圖2B)，圖像合并后未見表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞 (圖2C)。第2次貼壁細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中見綠色的熒光 (圖2D)，細(xì)胞核見藍(lán)色熒光 (圖2E)，圖像合并后見表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞占全部細(xì)胞的98% (圖2F),可見SP-C在該細(xì)胞有表達(dá)，細(xì)胞為AECⅡ細(xì)胞。

A～C：為第1次貼壁細(xì)胞；D～F：為第2次貼壁細(xì)胞。

2.3 對(duì)照組和GDM組胎鼠AECⅡ細(xì)胞改變

2.3.1透射電鏡觀察胎鼠AECⅡ細(xì)胞形態(tài)改變

透射電鏡下可見從對(duì)照組胎鼠肺原代培養(yǎng)的AECⅡ表面有豐富微絨毛，細(xì)胞內(nèi)有較多板層小體，而GDM組胎鼠肺原代培養(yǎng)的AECⅡ表面微絨毛減少，細(xì)胞內(nèi)板層小體明顯減少，見圖3。

A： 對(duì)照組(×10 000)；B：GDM組(×5 000)。

2.3.2AECⅡ和AECⅠ細(xì)胞數(shù)量變化

油鏡下見AECⅠ細(xì)胞是扁平細(xì)胞，其細(xì)胞核向表面邊緣突起并隔膜。AECⅡ細(xì)胞由立方體細(xì)胞組成，細(xì)胞核大，有血管。GDM組胎鼠肺組織中AECⅡ和AECⅠ細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組胎鼠肺組織降低。AECⅡ和AECⅠ細(xì)胞數(shù)量的比例在對(duì)照組胎鼠肺組織和GDM組胎鼠肺組織均約為2∶1，見圖4。

A： 對(duì)照組胎鼠；B： GDM組胎鼠；C：AECⅡ和AECⅠ數(shù)量;a:與對(duì)照組比較。

2.3.3AECⅡ細(xì)胞中脂滴變化

油紅O染色AECⅡ細(xì)胞，對(duì)照組胎鼠肺組織原代培養(yǎng)的AECⅡ細(xì)胞中見大量紅色脂滴，部分為團(tuán)狀堆積；而從GDM組胎鼠肺組織原代培養(yǎng)的AECⅡ細(xì)胞中脂滴明顯減少，見圖5。

A：對(duì)照組胎鼠；B：GDM組胎鼠；C：AECⅡ脂滴吸光度(A);a:P<0.05,與對(duì)照組胎鼠比較。

2.3.4SP-A在AECⅡ中的表達(dá)

對(duì)照組胎鼠肺組織原代培養(yǎng)的AECⅡ中SP-A表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，表達(dá)水平為0.85±0.11，GDM組胎鼠肺組織原代培養(yǎng)的AECⅡ中SP-A表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，著色較淺，表達(dá)水平為0.37±0.05(圖6)，對(duì)照組胎鼠高于GDM組胎鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3 討 論

本研究改進(jìn)了AECⅡ細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，采用了兩步消化法消化細(xì)胞：第1次消化時(shí)，采用胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、DnaseⅠ酶對(duì)胎肺組織進(jìn)行消化[5-6]。第2次消化時(shí)，僅僅采用Ⅰ型膠原酶和DnaseⅠ酶對(duì)已收集到的細(xì)胞進(jìn)行再次消化[7]。該方法減少了對(duì)細(xì)胞損傷的同時(shí)又提高了細(xì)胞的產(chǎn)量。純化過程中，采用IgG免疫黏附純化法的同時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)貼壁，得到了高產(chǎn)量、高純度的AECⅡ細(xì)胞[8-9]。

AECⅡ是成人干細(xì)胞，在慢性炎癥情況下，AECⅡ能分化成AECⅠ[10]。GDM胎鼠肺組織中AECⅠ細(xì)胞和AECⅡ細(xì)胞的總數(shù)明顯下降，而兩者之間的比例未發(fā)生改變[11]。其原因是高血糖可導(dǎo)致大量的ROS產(chǎn)生，使胚胎和胎兒中大量的細(xì)胞受損[12-13]，使肺泡間質(zhì)組織和 (或) 肺泡組織增殖和凋亡出現(xiàn)異常[14]，增加肺泡成纖維細(xì)胞的增殖，減少成纖維細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肺纖維化，同時(shí)限制AECⅠ和AECⅡ發(fā)育。研究表明高血糖只會(huì)增加肺泡間質(zhì)細(xì)胞的存活率，細(xì)胞分化處于紊亂狀態(tài)，大多數(shù)細(xì)胞處于分化狀態(tài)，不成熟細(xì)胞不能形成典型的結(jié)構(gòu)，例如已分化肺泡的囊狀結(jié)構(gòu)[15]。

AECⅡ細(xì)胞最重要的功能是產(chǎn)生和分泌肺泡表面活性物質(zhì)。肺泡表面活性物質(zhì)是復(fù)雜的脂類蛋白混合物，其中甘油磷脂約占80%，膽固醇約占10%，蛋白約占10%[16]。肺泡活性物質(zhì)主要儲(chǔ)存在板層小體內(nèi)。從GDM組胎鼠肺組織中提取的AECⅡ細(xì)胞，可見板層小體體積變小、數(shù)量減少，細(xì)胞表面微絨毛減少、消失，該結(jié)果表明GDM時(shí)胎肺的發(fā)育出現(xiàn)了延遲，其原因可能是肺糖原磷酸化酶A活性在異常增高的血糖環(huán)境中受到抑制，進(jìn)一步阻礙了糖原的降解，胎肺不能利用糖原，最終導(dǎo)致肺泡表面活性物質(zhì)生產(chǎn)減少。另一方面，肺泡表面活性物質(zhì)中磷脂主要是由脂質(zhì)轉(zhuǎn)化而來，油紅O染色顯示GDM組胎鼠肺組織AECⅡ中脂滴明顯減少，這表明妊娠期糖尿病能抑制脂質(zhì)的合成，進(jìn)而影響肺泡表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示GDM組胎鼠肺組織AECⅡ中SP-A表達(dá)明顯低于對(duì)照組。表明GDM組胎鼠肺組織AECⅡ因高血糖導(dǎo)致其功能受到抑制，肺泡表面活性物質(zhì)生成明顯減少，從而進(jìn)一步導(dǎo)致肺泡表面張力增加，使肺泡不能充分?jǐn)U張，影響新生兒肺氣體交換功能和肺功能，導(dǎo)致GDM孕婦分娩的新生兒容易出現(xiàn)呼吸窘迫癥。

此研究提示在妊娠期將GDM患者的血糖控制在正常水平能減少新生兒呼吸窘迫癥的發(fā)生，所以在臨床工作中需要全面嚴(yán)格開展GDM的篩查工作及GDM的臨床治療指導(dǎo)工作。對(duì)孕早期空腹血糖大于或等于6.1 mmol/L的孕婦，因按照GDM進(jìn)行管理和治療。對(duì)確診GDM的患者需要進(jìn)行規(guī)范化的治療，包括控制體重、糖尿病飲食、進(jìn)行連續(xù)低強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)及使用胰島素將血糖控制在合理范圍，同時(shí)在整個(gè)孕期加強(qiáng)對(duì)胎兒的監(jiān)測(cè)[17]。血糖控制滿意且不需要胰島素治療的GDM孕婦，可嚴(yán)密監(jiān)測(cè)血糖至預(yù)產(chǎn)期，未自然臨產(chǎn)者可積極終止妊娠。妊娠期間需要使用胰島素治療并血糖控制滿意的GDM孕婦，建議在妊娠38～39周終止妊娠。血糖控制不滿意的GDM孕婦，結(jié)合其他高危因素，適時(shí)終止妊娠，同時(shí)在分娩前可積極采取措施提早預(yù)防新生兒呼吸窘迫綜合征的發(fā)生。在分娩時(shí)應(yīng)密切監(jiān)測(cè)胎心的變化情況；在分娩后密切觀察新生兒生命體征并注意是否出現(xiàn)進(jìn)行性呼吸困難加重。當(dāng)臨床上一旦確診為新生兒呼吸窘迫綜合征應(yīng)聯(lián)合機(jī)械通氣與肺泡表面活性物質(zhì)治療，從而減少新生兒并發(fā)癥的發(fā)生[18]。

本研究在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)，GDM胎鼠肺組織AECⅡ形態(tài)發(fā)生改變、功能受到抑制。肺泡表面活性物質(zhì)生成明顯減少是GDM母親分娩的新生兒容易發(fā)生呼吸窘迫綜合征的重要原因，為臨床工作需要加強(qiáng)對(duì)GDM的篩查及規(guī)范化治療和管理，以降低新生兒呼吸窘迫綜合征的發(fā)生率提供了理論依據(jù)。