靳 程，孔令杰

(清華大學(xué) 精密儀器系，北京 100084)

憑借穿透深度深、低漂白、三維可分辨等優(yōu)勢(shì)，雙光子熒光顯微系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于在體生物動(dòng)態(tài)成像領(lǐng)域，并極大地推動(dòng)了神經(jīng)科學(xué)、免疫科學(xué)等生物醫(yī)學(xué)的研究[1-3]. 但是由于生物組織的非均勻性、各向異性等固有屬性，光在生物組織中傳輸時(shí)將經(jīng)歷隨機(jī)折射與散射，產(chǎn)生波前像差(樣本像差)，從而降低顯微成像質(zhì)量. 此外，考慮到實(shí)際成像系統(tǒng)還存在光學(xué)元件加工與裝配誤差、樣品放置不當(dāng)?shù)纫蛩匾鸬南到y(tǒng)像差，因此成像質(zhì)量將會(huì)進(jìn)一步受到影響[4-5]. 波前像差會(huì)造成衍射極限點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的畸變，從而會(huì)降低成像分辨率和對(duì)比度，甚至?xí)?dǎo)致圖像產(chǎn)生偽影，進(jìn)而造成生物結(jié)構(gòu)圖像的誤判. 因此了解波前像差對(duì)光學(xué)顯微成像質(zhì)量的影響，在生物醫(yī)學(xué)成像中尤為重要.

與單光子熒光顯微技術(shù)不同，雙光子熒光顯微技術(shù)基于雙光子吸收效應(yīng)實(shí)現(xiàn)了局域激發(fā)(即熒光信號(hào)僅在激發(fā)焦點(diǎn)附近產(chǎn)生)[6]. 雙光子熒光顯微技術(shù)通常采用點(diǎn)掃描方式對(duì)樣本進(jìn)行逐點(diǎn)激發(fā)成像，在每次激發(fā)下，無論樣本是否經(jīng)歷散射或隨機(jī)折射，系統(tǒng)收集的所有發(fā)射熒光均作為該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的樣本熒光信號(hào). 因此，雙光子熒光顯微成像引入的像差是指激發(fā)端光路引入的像差，此時(shí)波前像差所造成的激發(fā)光三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的畸變將嚴(yán)重影響激發(fā)效率及成像質(zhì)量[5].

本文結(jié)合清華大學(xué)“神經(jīng)光子學(xué)”課程的教學(xué)實(shí)踐[7]，詳細(xì)介紹了波前像差及其對(duì)雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的影響. 首先，系統(tǒng)介紹了波前像差的數(shù)學(xué)表達(dá)形式；然后，使用矢量仿真模型，對(duì)像差影響下的雙光子熒光顯微系統(tǒng)的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)進(jìn)行了數(shù)值仿真；最后，在雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)中，對(duì)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)畸變進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)觀測(cè)，進(jìn)一步說明了像差的不利影響和像差校正的必要性. 同時(shí)，還討論了如何設(shè)計(jì)教學(xué)方案，以引導(dǎo)學(xué)生加深對(duì)波前像差及其影響的認(rèn)識(shí).

1 波前像差的數(shù)學(xué)描述

像差影響著光學(xué)系統(tǒng)成像質(zhì)量. 為便于量化像差造成的影響，通常采用波前像差(即實(shí)際波面與理想波面之間的光程差)研究像質(zhì)評(píng)價(jià)問題[2]. 其中，澤尼克圓多項(xiàng)式被廣泛應(yīng)用于波前像差的表征. 澤尼克圓多項(xiàng)式一般用下式定義[8]：

(1)

其中，

一般地，像差引入的相位偏移量可以表示為

圖1 各澤尼克模式所描述的波前像差分布

2 波前像差造成雙光子熒光顯微中點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)畸變的數(shù)值仿真

點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)即光學(xué)系統(tǒng)的脈沖響應(yīng)函數(shù). 光學(xué)系統(tǒng)所成的像，可理解為物像與點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的卷積[4]. 因此可通過分析點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)畸變來評(píng)價(jià)像差對(duì)成像質(zhì)量的影響. 考慮到雙光子熒光顯微等非線性光學(xué)顯微成像需使用高數(shù)值孔徑的物鏡以提高激發(fā)效率，可采用矢量衍射理論來描述焦點(diǎn)附近的電場(chǎng)分布[9]. 衍射積分公式可以寫成：

(2)

其中E(x1,y1,z1)表示點(diǎn)(x1,y1,z1)處的電場(chǎng)分布，C是歸一化常量，α是取決于物鏡數(shù)值孔徑的光束最大所張成的半角大小，A(θ,φ)是入射光束的振幅分布，B(θ,φ)是切趾因子，P(θ,φ)描述激發(fā)光束的偏振態(tài)對(duì)矢量場(chǎng)的影響，M(θ,φ)指波前像差. 經(jīng)物鏡聚焦的入射光的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)可以表示為

hex(x1,y1,z1)=|Ex|2+|Ey|2+|Ez|2.

(3)

在雙光子熒光顯微成像中，實(shí)際的有效激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)是入射光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的平方，可以表示為

(4)

在仿真中，選擇x方向偏振的理想平面波作為激發(fā)光束，其波長(zhǎng)為920 nm，同時(shí)選擇數(shù)值孔徑為0.8的水浸物鏡.

圖2 各澤尼克模式所對(duì)應(yīng)像差引起的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)畸變

3 波前像差造成雙光子熒光顯微中點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)畸變的實(shí)驗(yàn)研究

雙光子熒光顯微系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意如圖3所示. 摻鈦藍(lán)寶石激光器產(chǎn)生的飛秒脈沖(～120 fs)，經(jīng)過透鏡L1和L2構(gòu)成的4f系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)束，使擴(kuò)束后的光斑尺寸與靈敏電流計(jì)振鏡(GM1和GM2)的靶面尺寸匹配. 激發(fā)光經(jīng)過靈敏電流計(jì)振鏡后再經(jīng)過掃描透鏡(SL)、管透鏡(TL)、二向色鏡(DM)和物鏡(OL)到達(dá)樣本面，即可在焦點(diǎn)處產(chǎn)生雙光子吸收. 所激發(fā)出的雙光子熒光信號(hào)會(huì)被物鏡反向收集，再經(jīng)過二向色鏡、透鏡L3、濾波片(F)后被光電倍增管(PMT)探測(cè)，即得到對(duì)應(yīng)位置的雙光子熒光信號(hào). 2個(gè)沿正交方向振動(dòng)的靈敏電流計(jì)振鏡(GM1和GM2)可以實(shí)現(xiàn)飛秒脈沖光束在樣本面上的二維點(diǎn)掃描，由此得到對(duì)應(yīng)的二維雙光子熒光顯微圖像.

圖3 雙光子熒光顯微系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

考慮到雙光子顯微成像系統(tǒng)的成本問題，通常采用無校正環(huán)的物鏡， 此時(shí)會(huì)出現(xiàn)折射率不匹配的問題，從而導(dǎo)致球差的出現(xiàn)，該種情況最為常見且對(duì)成像質(zhì)量的影響最大. 因此，下面以球差為例，通過實(shí)驗(yàn)說明雙光子熒光顯微系統(tǒng)中像差對(duì)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的影響.

本文采用帶有校正環(huán)的水浸物鏡(Olympus, XLPLN25XWMP2, NA1.05,25×)作為雙光子熒光顯微系統(tǒng)的物鏡，使用直徑為0.2 μm的熒光微球(Thermofisher, G200)對(duì)該系統(tǒng)的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)標(biāo)定，激發(fā)光波長(zhǎng)為 920 nm. 在實(shí)際光學(xué)顯微成像中，當(dāng)將生物樣品置于一定厚度的蓋玻片下時(shí)，由于玻璃、水、生物樣品的折射率不同，聚焦的激發(fā)光將會(huì)引入球差，從而造成激發(fā)光三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的畸變，且隨著成像深度的增加，球差增大，導(dǎo)致成像質(zhì)量顯著下降.

實(shí)驗(yàn)中將熒光微球樣本放置于1.5號(hào)蓋玻片下，蓋玻片的折射率為1.51，水的折射率為1.33，若不進(jìn)行像差校正，激發(fā)光經(jīng)過折射率不匹配的2層介質(zhì)聚焦會(huì)引入球差. 由于所使用的物鏡校正環(huán)具有球差補(bǔ)償功能，其基本原理是通過機(jī)械旋轉(zhuǎn)該校正環(huán)，改變物鏡中特定內(nèi)置透鏡的間距，從而改變不同光瞳半徑的光引入的光程，進(jìn)而補(bǔ)償原本由于折射率不匹配造成的球差. 圖4(a)為調(diào)節(jié)物鏡校正環(huán)使球差得到完全補(bǔ)償時(shí)，所測(cè)量的系統(tǒng)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，其橫向、軸向分辨率分別為0.56 μm,2.9 μm. 圖4(b)為調(diào)節(jié)物鏡校正環(huán)使引入的球差補(bǔ)償量最小時(shí)，得到系統(tǒng)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，其橫向、軸向分辨率分別為0.59 μm,4.11 μm. 圖4(c)為調(diào)節(jié)物鏡校正環(huán)使引入的球差補(bǔ)償量最大時(shí)，得到系統(tǒng)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，其橫向、軸向分辨率分別為0.71 μm,6.29 μm.

圖4 物鏡校正環(huán)補(bǔ)償球差時(shí)，雙光子熒光顯微系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)

同時(shí)，對(duì)使用上述物鏡時(shí)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)進(jìn)行數(shù)值仿真，模擬1.5號(hào)蓋玻片(取蓋玻片厚度為0.17mm)引入的球差對(duì)系統(tǒng)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的x-z截面分布情況的影響.仿真結(jié)果[圖5(b)]與實(shí)驗(yàn)結(jié)果中球差欠補(bǔ)償[圖6(b)]時(shí)的軸向強(qiáng)度分布趨勢(shì)一致.

從數(shù)值仿真和實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)球差不能得到有效補(bǔ)償時(shí)，三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)分布會(huì)偏離理想情況，軸向分辨率明顯變差，同時(shí)產(chǎn)生軸向次主瓣，使主瓣能量占比下降. 這些情況都會(huì)降低雙光子激發(fā)效率，因此在進(jìn)行雙光子熒光顯微成像實(shí)驗(yàn)前要調(diào)節(jié)物鏡校正環(huán)使之恰好補(bǔ)償系統(tǒng)的固有球差.

(a)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)仿真圖

(b)強(qiáng)度分布曲線圖5 平板玻璃引入球差后，點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的仿真圖及軸向強(qiáng)度分布曲線

(a)恰補(bǔ)償

(b)欠補(bǔ)償

(c)過補(bǔ)償圖6 三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)軸向強(qiáng)度分布的高斯擬合曲線

4 結(jié)束語

本文分析了各澤尼克多項(xiàng)式所描述的像差，基于矢量衍射理論研究了波前像差對(duì)雙光子熒光顯微系統(tǒng)中三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的影響，并通過熒光微球的雙光子熒光成像實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了球差造成的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)畸變. 在生物顯微成像中，可采用自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)補(bǔ)償光學(xué)系統(tǒng)及生物樣品所引入的波前像差[4,10]，降低三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)畸變，以提高雙光子熒光的激發(fā)效率，并進(jìn)一步提高成像深度. 在實(shí)際教學(xué)中，通過將課堂講述的理論基礎(chǔ)與課下數(shù)值仿真及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合，能夠讓學(xué)生深刻理解雙光子熒光顯微系統(tǒng)中波前像差對(duì)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的影響.