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        不同炮制方法對(duì)黃芩活性成份含量及抗氧化作用的影響

        2021-11-03 07:46:14高可新李利霞王小康
        中國(guó)合理用藥探索 2021年9期

        高可新,李利霞,王小康

        (焦作市中醫(yī)院 1 中藥劑科,2 藥學(xué)部,焦作 454150)

        黃芩始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根,味苦性寒,具有清熱燥濕、瀉火解毒和止血安胎的功效[1]。臨床應(yīng)用有生黃芩及其炮制品,如蒸黃芩、煮黃芩、姜黃芩、蜜黃芩、炒黃芩、酒黃芩和黃芩炭等,其中以酒黃芩臨床應(yīng)用較多。生黃芩清熱瀉火解毒力強(qiáng),善于治療熱病、濕溫黃疸、濕熱瀉痢及乳癰發(fā)背等。酒黃芩入血分,酒炙能引藥上行,緩和生黃芩的寒性,增強(qiáng)清上焦肺熱的功效。

        黃酮類化合物是黃芩的主要活性物質(zhì),代表成份為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷以及漢黃芩素等。研究表明[2-3],黃芩中黃酮類化合物具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、保肝利膽、抗菌消炎和抗過(guò)敏作用,以及對(duì)免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等的保護(hù)作用。

        本研究以黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷以及漢黃芩素含量和抗氧化作用為指標(biāo),考察不同炮制方法對(duì)黃芩活性成份及抗氧化作用的影響,從化學(xué)和生物藥理學(xué)角度探索黃芩炮制原理?,F(xiàn)報(bào)道如下。

        1 材料

        1.1 儀器

        Agilent1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);DAD檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司);UV755B型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司);FW100型萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司);XS205型分析天平(Mettler Toledo公司)等。

        1.2 試藥

        黃芩苷(批號(hào):110715-201821,純度:95.4%)、黃芩素(批號(hào):111595-201808,純度:97.9%)、漢黃芩素(批號(hào):111514-201706,純度:96.8%)以及漢黃芩苷(批號(hào):112002-201702,純度:98.5%)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純,購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;其余試劑均為分析純。

        2 研究方法

        2.1 黃芩的炮制

        本研究所用黃芩原藥材采購(gòu)于河北藺氏盛泰藥業(yè)有限公司(批號(hào):1909051132),經(jīng)張志儉主任鑒定為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。黃芩炮制品的制備均按《中國(guó)藥典》2020年版“0213 炮制通則”[4]自行炮制。

        生黃芩:取黃芩藥材,除去雜質(zhì),置沸水中煮10 min,取出,悶透,切薄片,干燥。

        酒黃芩:取生黃芩片,每1000 g生黃芩片,加黃酒120 g拌勻,悶透,用文火炒至表面呈微黃色,取出,放涼。

        2.2 活性成份的檢測(cè)

        2.2.1對(duì)照品溶液的制備

        精密稱取黃芩苷10.432 mg、黃芩素2.646 mg、漢黃芩苷2.715 mg、漢黃芩素2.385 mg,于10 ml棕色量瓶中,用適量甲醇溶解并定容,制得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。將混合對(duì)照品儲(chǔ)備液分別稀釋2、4、6、8、16倍,制成不同濃度的混合對(duì)照品溶液。

        2.2.2供試品溶液的制備

        稱取生黃芩和酒黃芩各100 g,用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎,過(guò)3號(hào)篩,備用。精密稱取生黃芩和酒黃芩粉末各0.3 g,分別加入40 ml 70%乙醇,回流提取2次,每次1 h,合并濾液,70%乙醇定容至100 ml,混勻。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,制成供試品溶液,平行試驗(yàn)3次。

        2.2.3色譜條件

        Polaris C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相0.1%甲酸(A)-乙腈(B),流速1.0 ml/min,柱溫35 ℃,進(jìn)樣體積20 μl,檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm。洗脫條件:0~5 min,25%B;5~15 min,25%→55%B;15~22 min,55%B;22~23 min,55%→25%B;23~30 min,25%B。

        2.3 抗氧化活性的測(cè)定

        2.3.1DPPH清除率

        取生黃芩和酒黃芩的供試品溶液各1 ml,分別加入3 ml 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液,混勻后,乙醇定容至10 ml,避光處反應(yīng)30 min后,在517 nm處測(cè)定吸光值。以純化水作為空白對(duì)照,0.1 mg/ml抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照,計(jì)算DPPH清除率。IC50表示對(duì)自由基的抑制率為50%時(shí)的試樣溶液濃度。將待測(cè)抗氧化劑配制成系列溶液,測(cè)定各濃度抗氧化劑對(duì)DPPH的清除率,在清除率20%~80%范圍內(nèi),繪制清除率-濃度曲線,計(jì)算出清除率為50%時(shí)的濃度值,即為IC50值。

        2.3.2·OH清除率

        取生黃芩和酒黃芩的供試品溶液各1 ml,分別加入0.1 ml 10 mmol/L FeSO4·7 H2O、0.1 ml 10 mmol/L EDTA、0.5 ml 10 mmol/L 2-D-脫氧核糖溶液和0.9 ml 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4);混勻后,加入0.2 ml 10 mmol/L H2O2;37 ℃水浴60 min后,用1.0 ml 2.8% TCA終止反應(yīng);加入1.0 ml 1.0%硫代巴比妥酸,沸水浴15 min;取出冷卻后,在532 nm處測(cè)定吸光值。以磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)作為空白對(duì)照,0.1 mg/ml抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照,計(jì)算·OH清除率和IC50值。計(jì)算公式同“2.3.1”項(xiàng)下公式。

        2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        3 結(jié)果

        3.1 方法學(xué)考察

        3.1.1線性與范圍

        以各成份對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),峰面積為縱坐標(biāo)(y),作線性回歸方程。結(jié)果:黃芩苷y=11.72x+175.62(r2=0.9994),線性范圍為65.20~1043.20 μg/ml;黃芩素y=17.96x-86.29(r2=0.9997),線性范圍為16.54~264.60 μg/ml;漢黃芩苷y=17.55x+10.39(r2=0.9995),線性范圍為16.97~271.50 μg/ml;漢黃芩素y=8.14x-42.34(r2=0.9993),線性范圍為14.91~238.50 μg/ml。

        3.1.2精密度試驗(yàn)

        取酒黃芩樣品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.3”項(xiàng)下色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6次。記錄黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素峰面積。結(jié)果:黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素峰面積RSD分別為0.75%、0.80%、0.96%和0.76%,表明儀器精密度良好。

        3.1.3重復(fù)性試驗(yàn)

        取酒黃芩樣品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.2.3”項(xiàng)下色譜方法依次進(jìn)樣分析,記錄黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素峰面積。結(jié)果:黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素峰面積RSD分別為1.15%、1.33%、1.30%和1.84%,表明該方法重復(fù)性良好。

        3.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取酒黃芩樣品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.3”項(xiàng)下色譜方法立即進(jìn)樣分析,分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,記錄黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素不同時(shí)間峰面積。結(jié)果:黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素峰面積RSD分別為0.28%、0.83%、0.34%和0.56%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        3.1.5回收率試驗(yàn)

        取酒黃芩樣品0.15 g,精密加入各適量對(duì)照品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.3”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣分析,根據(jù)檢測(cè)量和加入量計(jì)算黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素的加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1,表明各檢測(cè)指標(biāo)回收率良好。

        表1 加樣回收率結(jié)果n=6,%

        3.2 活性成份含量測(cè)定

        本研究對(duì)生黃芩和酒黃芩中4種黃酮類成份進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果:酒黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷含量低于生黃芩、黃芩素和漢黃芩素含量高于生黃芩(P<0.05)。見(jiàn)表2。

        表2 生黃芩和酒黃芩的活性成份含量測(cè)定

        3.3 抗氧化作用

        表3 生黃芩和酒黃芩的抗氧化作用

        4 討論與結(jié)論

        中藥的炮制有重要意義,表現(xiàn)為去掉非藥用部位、泥沙、灰塵等雜質(zhì);便于粉碎和制劑;矯正不良?xì)馕?;降低毒性、減少毒副作用、緩和刺激性;改變藥物性能;增加藥物療效;引藥歸經(jīng)等。黃芩為我國(guó)的大宗藥材之一,味苦性寒,瀉火力強(qiáng),臨床應(yīng)用前常需炮制。中醫(yī)認(rèn)為“酒炙則升”,生黃芩經(jīng)酒炙后,可引藥上行,屬于“相反為制”范疇。酒黃芩可借酒的升騰之力,作用于上焦及頭面部,有利于清上焦肺熱和四肢膚表之濕熱,又因酒性大熱,可緩解黃芩苦寒之性,減少對(duì)脾陽(yáng)的損傷[5]。

        目前從黃芩中分離得到的成份多達(dá)40種,主要包括黃酮類、苯甲酸、多糖、氨基酸以及微量元素等。其中,黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素可作為黃芩藥材及其有關(guān)制劑的質(zhì)控指標(biāo)[6]。黃芩在炮制后,化學(xué)成份會(huì)發(fā)生一定程度的變化。本研究對(duì)生黃芩和酒黃芩中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,酒黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷含量低于生黃芩,黃芩素和漢黃芩素含量高于生黃芩(P<0.05)。分析原因:可能與黃芩藥材中的酶類物質(zhì)及水解作用有關(guān)。生黃芩中的酶可促進(jìn)黃芩苷和漢黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素和漢黃芩素,經(jīng)過(guò)高溫滅活,可殺酶保苷,但高熱也可能會(huì)引起黃芩苷和漢黃芩苷的分解,使含量降低。黃芩素、漢黃芩素含量的升高,說(shuō)明酒炙后黃芩苷和漢黃芩苷被分解為苷元,且分解作用大于殺酶保苷作用。

        活性氧(reactive oxygen species,ROS)在生物體中有非常重要的信號(hào)傳導(dǎo)作用,其含量過(guò)高時(shí)可引起線粒體的氧化應(yīng)激反應(yīng),損傷脂類、蛋白質(zhì)和核酸等細(xì)胞大分子物質(zhì),進(jìn)而引起癌癥、心血管疾病以及神經(jīng)退行性疾病等嚴(yán)重疾病的發(fā)生[7]??寡趸瘎┦蔷S持生命健康的主要物質(zhì),可有效減慢或抑制過(guò)量自由基對(duì)機(jī)體的損傷,降低重大疾病發(fā)病率?,F(xiàn)有的抗氧化劑包括人工合成抗氧化劑和天然抗氧化劑。人工合成抗氧化劑存在多種不良反應(yīng),可能會(huì)對(duì)肝、脾、肺等器官造成損傷;天然抗氧化劑源自植物,相對(duì)更加安全有效,具有較強(qiáng)的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

        綜上所述,生黃芩經(jīng)酒炙后黃芩苷和漢黃芩苷含量降低,黃芩素和漢黃芩素含量升高,抗氧化作用增加。

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