孟建升，蔣俊春，鄭志安，韓知利，肖紅偉，王 輝

(1 商丘市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，商丘 476001；2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083)

姜棗祛寒顆粒由干姜和大棗加工而成，具有發(fā)散祛寒、和胃溫中的功效。臨床主要用于風(fēng)寒感冒、胃寒疼痛。收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第二冊[1]，干姜為方中君藥，為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根莖，具有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲的功效[2]，其有效成份為姜酚和姜烯酚，包括6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚等[3]?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)研究僅對姜棗祛寒顆粒中的6-姜辣素進(jìn)行定量研究[4]，未檢索到對姜酚類成份測定的報(bào)道。為全面評價(jià)姜棗祛寒顆粒的質(zhì)量，本研究建立高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法同時(shí)測定姜棗祛寒顆粒中6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的含量，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；XS-205DU電子分析天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司]；SB-800DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥

6-姜酚對照品(上海麥克林生化科技有限公司，批號：M00118003，純度≥90%)；8-姜酚對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：P24A10F96114，純度≥98%)；6-姜烯酚對照品[阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號：G1915196，純度≥98%]；10-姜酚對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：P20N6F6295，純度≥98%)；姜棗祛寒顆粒(甘肅中天金丹藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z62021207，規(guī)格15 g/袋，批號：180602、180903、181105、190703、190906、191108)；乙腈(德國默克公司，色譜純)；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1對照品溶液的制備

分別精密稱取6-姜酚對照品、8-姜酚對照品、6-姜烯酚對照品、10-姜酚對照品適量，加80%甲醇溶液制成濃度分別為0.1470、0.1824、0.1194、0.1012 mg/ml的混合對照品儲(chǔ)備液，置5 ℃±3 ℃冰箱中冷藏儲(chǔ)存。精密量取上述混合對照品儲(chǔ)備液5.00 ml，置25 ml量瓶中，加80%甲醇溶液至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備

取供試品適量，置研缽中，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，加80%甲醇30 ml，超聲處理30 min，放至室溫，加80%甲醇溶液至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液[5-6]。

2.1.3陰性對照溶液的制備

取大棗，按照姜棗祛寒顆粒的制備工藝制作陰性樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.2 色譜條件

Thermo Syncronis C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(見表1)，流速1.0 ml/min，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量20 μl，柱溫30 ℃[7-9]。

表1 梯度洗脫程序

2.3 專屬性考察

取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各20 μl，注入高效液相色譜儀，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1。表明4種對照品在相應(yīng)的主峰位置分離良好，不受干擾。

A:混合對照品;B:供試品;C:陰性對照1: 6-姜酚；2: 8-姜酚；3: 6-姜烯酚；4: 10-姜酚圖1 高效液相色譜圖

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1線性關(guān)系考察

精密量取混合對照品儲(chǔ)備液0.5、1、2、5、10 ml分別置于25 ml量瓶中，加80%甲醇溶液至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，精密吸取濾液20 μl，注入高效液相色譜儀，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以對照品濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，4種成份在各自的濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

表2 4種成份的線性關(guān)系

2.4.2精密度試驗(yàn)

精密量取同一供試品溶液(批號：191108)20 μl，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果：6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚峰面積的RSD(n=5)分別為0.99%、1.24%、1.62%和1.76%，表明精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取同一供試品溶液(批號：191108)20 μl，于0、1、2、5、10、15、24 h進(jìn)行測定。結(jié)果：6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚峰面積的RSD分別為1.03%、1.55%、1.29%和1.87%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一供試品細(xì)粉(批號：191108)0.5 g，6份，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測定。結(jié)果：6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚峰面積的RSD分別為1.63%、1.74%、1.56%和1.79%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的供試品細(xì)粉(批號：191108)0.25 g，9份，精密加入對照品溶液(含6-姜酚濃度為0.1470 mg/ml、8-姜酚濃度為0.0248 mg/ml、6-姜烯酚濃度為0.0387 mg/ml、10-姜酚濃度為0.0427 mg/ml)4、5、6 ml，各3份，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備溶液，分別測定6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。結(jié)果表明各檢測指標(biāo)回收率良好。

表3 加樣回收率結(jié)果 n=9

2.5 含量測定

取6批樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚和10-姜酚含量，結(jié)果見表4。

表4 4種成份含量測定結(jié)果 mg/g

3 討論

3.1 供試品溶液的制備方法選擇

姜棗祛寒顆粒是將處方中的飲片加工成流浸膏再制顆粒，考慮到4種成份同時(shí)提取測定，本研究分別采用50%甲醇、80%甲醇、甲醇回流提取和超聲提取，并進(jìn)行比較。結(jié)果：采用80%甲醇溶液超聲30 min所提取的6-姜酚含量最高(見表5)，且操作簡便。故選擇此方法作為供試品的提取方法。

表5 不同提取溶劑及方式下6-姜酚含量測定結(jié)果 mg/g

3.2 流動(dòng)相的選擇

4種成份同時(shí)測定，色譜條件的關(guān)鍵在于流動(dòng)相。本研究采用了不同比例的乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲醇-水、乙腈-甲醇-磷酸溶液系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫。經(jīng)比較，采用乙腈-水梯度洗脫系統(tǒng)，響應(yīng)和峰形最好，基線平穩(wěn)，各指標(biāo)成份達(dá)到基線分離，結(jié)果穩(wěn)定，故選流動(dòng)相為乙腈-水梯度洗脫系統(tǒng)。

3.3 測定波長、柱溫及流速的選擇

采用紫外檢測器對供試品溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果各成份在280 nm均有最大響應(yīng)，故選擇280 nm作為測定波長。在實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)室溫度控制在25～30 ℃范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受影響。為了保持實(shí)驗(yàn)條件的一致性，柱溫選擇30 ℃。流速選擇1.0 ml/min，柱壓穩(wěn)定，峰型良好。

3.4 檢測成份的選擇

據(jù)報(bào)道[10-11]，姜酮也是生姜的有效成份之一，但是本研究條件下姜酮含量較低，峰型不理想，故未納入本研究中，后續(xù)研究將深入地研究姜酮的提取和分離。

本研究建立的HPLC法同時(shí)測定姜棗祛寒顆粒中4種成份的含量，方法簡便，易于操作，為該制劑的質(zhì)量可控提供參考，同時(shí)為其他干姜制劑的全面質(zhì)量控制提供新的方法和思路。