王愛霞 劉瑋芳 王春平

甲狀腺癌(TC)是常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，最近幾十年來在世界范圍內(nèi)迅速增加[1]。根據(jù)2014年世界癌癥報(bào)告，全球約有298,000例新的TC病例和40,000例死亡病例[2]。根據(jù)2015年的中國癌癥統(tǒng)計(jì)資料，TC已成為中國女性中的第六位惡性腫瘤，也是30歲以下女性中最常見的腫瘤[3]。此外，TC的復(fù)發(fā)率很高，導(dǎo)致治愈率下降和死亡率顯著增加，這嚴(yán)重危害了人類健康[4]。目前，最常見的TC治療方法是手術(shù)結(jié)合放射療法或化學(xué)療法。但是，它對耐受性乳頭狀癌，未分化癌和髓樣癌沒有很好的療效，并且在癌癥復(fù)發(fā)和對人體的危害方面仍存在爭議[5]。因此，探索TC的腫瘤發(fā)生機(jī)制，尋找影響TC細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)鍵分子，是TC治療的重要途徑。miRNA是一大類微小的非編碼RNA，它們是內(nèi)源編碼的，并通過與靶mRNA的3'UTR區(qū)結(jié)合而負(fù)調(diào)控基因表達(dá)，從而導(dǎo)致mRNA的翻譯抑制或降解[6]。Vriens等[7]通過高通量測序發(fā)現(xiàn)TC癌組織和TC癌旁組織中miRNA的表達(dá)種類顯著不同，包括miR-548t-3p。然而，miR-548t-3p在TC細(xì)胞中的功能尚未得到研究。基于此，本研究旨在探討miR-548t-3p調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

甲狀腺癌細(xì)胞SW579、B-CPAP、8305C、BHT101、CAL-62、KHM-5M、TPC-1、FTC-133、HTh-7均購自普諾賽公司(貨號：CL-0457,CL-0575,CL-0613,CL-0617,CL-0618,CL-0623,CL-0643,CL-0644,CL-0647)。miR-548t-3p mimcis,miR-548t-3p inhibitor,siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒均有北京擎科合成。lipo3000轉(zhuǎn)染試劑購自武漢市武昌區(qū)科邁實(shí)驗(yàn)用品經(jīng)營部(貨號：L3000015)。TRIzol試劑購自四川愛奇生物科技有限公司(貨號：15596026)。第一鏈cDNA合成試劑盒購自寶如億(北京)生物技術(shù)有限公司(貨號：N118-1-1)。BCA蛋白測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號：P0012)。CITED2抗體購自廣州吉英生物科技有限公司(貨號：46505)。GAPDH抗體購自廣州洛唯爾生物科技有限公司(貨號：ab8245)。FITC-Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司(貨號：22839)。熒光素酶檢測試劑盒購自北京伊諾凱科技有限公司(貨號：N1150)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料 納入2020年1月至2021年1月我院收治的甲狀腺癌患者62例；其中男性25例，女性37例，年齡31～77歲，平均年齡(47.32±9.45)歲；腫瘤直徑1.0～3.6 cm，平均直徑為(1.77±0.82)cm；依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟《TNM惡性腫瘤分類》第7版進(jìn)行TNM分期：均為Ⅲ期。甲狀腺癌患者均經(jīng)我院病理科證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心、肝、腎功能損害者。②長期使用皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑者。③患有精神疾病者。④患有其他腫瘤者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，受試者均簽署知情同意書。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將CAL-62、KHM-5M、TPC-1、FTC-133、HTh-7細(xì)胞保持在1640培養(yǎng)基中，將SW579、B-CPAP、8305C、BHT101細(xì)胞保持在DMEM培養(yǎng)基中，并補(bǔ)充10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素。將上述細(xì)胞放置與5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將甲狀腺癌細(xì)胞以2×105/孔的密度接種在6孔板中，以進(jìn)行RNA干擾。將miR-548t-3p mimcis,miR-548t-3p inhibitor,siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒分別與lipo3000轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫靜置15 min后緩緩滴入甲狀腺癌細(xì)胞中。

1.2.3 RNA抽取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)制造商的規(guī)程，使用TRIzol試劑提取總RNA，并使用第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在ABI 7500系統(tǒng)上在以下條件下進(jìn)行qRT-PCR：95 ℃持續(xù)30 s;95 ℃持續(xù)5 s(40個(gè)循環(huán));60 ℃持續(xù)30 s，72 ℃持續(xù)15 s。使用GAPDH作為內(nèi)部對照計(jì)算基因的相對表達(dá)水平。

1.2.4 免疫印跡 處理后收集甲狀腺癌細(xì)胞裂解液，并用雙辛可寧酸(BCA)蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳，然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與抗CITED2抗體作為一抗和抗GAPDH抗體作為內(nèi)參。隨后，將膜與適當(dāng)?shù)亩乖谑覝叵路跤? h。信號用化學(xué)發(fā)光底物試劑盒成像，并通過凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.2.5 甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡檢測 用胰蛋白酶收集甲狀腺癌細(xì)胞，并用冰冷的D-Hanks溶液洗滌2次。然后，根據(jù)制造商的說明，使用FITC-Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行Annexin V/PI染色。使用貝克曼計(jì)數(shù)器流式細(xì)胞儀分析樣品。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用FuGENE HD將50 μg的熒光素酶報(bào)告載體和150 μg的pLL3.7-miR-548t-3p或pLL3.7-miR-對照載體轉(zhuǎn)染到96孔板中的1.5×104SW579細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48 h，按照制造商的說明，使用雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)測量熒光素酶活性。將海腎熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為螢火蟲熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的要求，所有結(jié)果均通過至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。由于異常分布或方差的異質(zhì)性，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，并使用Mann-Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-548t-3p在甲狀腺癌組織和甲狀腺癌旁組織中的表達(dá)水平

miR-548t-3p在甲狀腺癌組織的表達(dá)水平顯著高于甲狀腺癌旁組織(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-548t-3p在甲狀腺癌組織和甲狀腺癌旁組織中的表達(dá)水平

2.2 miR-548t-3p抑制甲狀腺癌細(xì)胞凋亡

過表達(dá)miR-548t-3p后，甲狀腺癌細(xì)胞SW579、B-CPAP、8305C、BHT101、CAL-62、KHM-5M、TPC-1、FTC-133、HTh-7的凋亡水平均下降(P<0.05)；而敲低miR-548t-3p后，甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡水平均上升(P<0.05)，見圖2。

圖2 miR-548t-3p抑制甲狀腺癌細(xì)胞凋亡

2.3 miR-548t-3p靶向CITED2調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞凋亡

通過miRDB在線分析發(fā)現(xiàn)miR-548t-3p潛在靶向92個(gè)基因的mRNA。在甲狀腺癌細(xì)胞SW579中過表達(dá)miR-548t-3p后，檢測上述基因mRNA水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-548t-3p能夠顯著降低SNRK、VASP、CITED2的mRNA水平(P<0.05)，見圖3A。使用siRNA敲低SNRK、VASP、CITED2后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲低CITED2時(shí)，甲狀腺癌細(xì)胞SW579的凋亡水平顯著下降(P<0.05)，見圖3B。過表達(dá)CITED2后，甲狀腺癌細(xì)胞SW579的凋亡水平顯著上升(P<0.05)，見圖3C。敲低miR-548t-3p后，CITED2的蛋白表達(dá)水平顯著上升，見圖3D。過表達(dá)miR-548t-3p后，CITED2的蛋白表達(dá)水平顯著下降，見圖3E。同時(shí)，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-548t-3p靶向CITED2的3端非編碼區(qū)(P<0.05)，見圖3F。同時(shí)敲低miR-548t-3p和CITED2，SW579細(xì)胞的凋亡水平無顯著改變(P>0.05)；同時(shí)過表達(dá)miR-548t-3p和CITED2，SW579細(xì)胞的凋亡水平無顯著改變(P>0.05)，見圖4。

圖3 CITED2調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞凋亡

圖4 miR-548t-3p靶向CITED2調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞凋亡

3 討論

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，每年占全世界癌癥發(fā)生率的1.3%和癌癥死亡率的0.5%[8]。根據(jù)組織病理類型，甲狀腺癌分為乳頭狀甲狀腺癌，濾泡性甲狀腺癌，未分化甲狀腺癌和髓樣癌[9]。最常見的類型是乳頭狀甲狀腺癌，約占甲狀腺癌的70%～80%[10]。因此，深入了解甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制將有助于確定新的診斷和治療方法。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)miR-548t-3p在甲狀腺癌組織的表達(dá)水平顯著高于甲狀腺癌旁組織(P<0.05)。過表達(dá)miR-548t-3p后，甲狀腺癌細(xì)胞SW579、B-CPAP、8305C、BHT101、CAL-62、KHM-5M、TPC-1、FTC-133、HTh-7的凋亡水平均下降(P<0.05)；而敲低miR-548t-3p后，甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡水平均上升(P<0.05)。miRNA是一類非蛋白質(zhì)編碼的單鏈RNA分子，由內(nèi)源基因編碼，長度為19～25個(gè)核苷酸，在物種中高度保守[11]。miRNA通常作用于一個(gè)或多個(gè)mRNA，并通過降解mRNA或抑制翻譯水平來負(fù)面調(diào)節(jié)基因表達(dá)[12]。提示miR-548t-3p通過降解某個(gè)底物來調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡。

過表達(dá)miR-548t-3p后， miR-548t-3p能夠顯著降低SNRK、VASP、CITED2的mRNA水平(P<0.05)。敲低SNRK、VASP、CITED2后，僅當(dāng)敲低CITED2時(shí)，甲狀腺癌細(xì)胞SW579的凋亡水平顯著下降(P<0.05)。盡管敲低SNRK和VASP并沒有影響甲狀腺癌細(xì)胞SW579的凋亡，但是miR-548t-3p靶向SNRK和VASP在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的其他作用仍然值得進(jìn)一步探討。

過表達(dá)CITED2后，甲狀腺癌細(xì)胞SW579的凋亡水平顯著上升(P<0.05)。敲低miR-548t-3p后，CITED2的蛋白表達(dá)水平顯著上升。過表達(dá)miR-548t-3p后，CITED2的蛋白表達(dá)水平顯著下降。多項(xiàng)研究證實(shí)[13-14]，CITED2可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能是CITED2是CBP / p300的負(fù)調(diào)節(jié)劑，而CBP/p300是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，可以通過乙?；?例如在Lys-373上)穩(wěn)定p53，并在p53穩(wěn)定性中起重要作用[15]。因此，miR-548t-3p抑制了CITED2，隨后p53積累減少最終抑制了細(xì)胞凋亡。此外，據(jù)報(bào)道丟失CITED2可以防止MYC與HDAC1相互作用，從而引起p21CIP1啟動(dòng)子的活化和細(xì)胞的靜止[16]。這些結(jié)果與我們的結(jié)果一致，表明miR-548t-3p干擾可能通過下調(diào)CITED2的表達(dá)并隨后影響p53和p21的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-548t-3p通過靶向CITED2 mRNA的3端非編碼區(qū)，降解了CITED2 mRNA并減少了CITED2的蛋白表達(dá)，最終抑制了甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡。