厲艷君， 吳立敏， 周 瑩， 陳 鷹， 郝玉紅

（上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院，上海 201203）

0 引 言

作為微觀結(jié)構(gòu)的一種重要分析表征手段，透射電子顯微技術(shù)（TEM）以其超高的分辨能力和直觀性廣泛應(yīng)用于材料、醫(yī)學(xué)、生物和地質(zhì)科學(xué)等研究領(lǐng)域，具有不可取代的地位［1-4］。對(duì)于蛋白、膠束、脂質(zhì)體等生物納米材料，由于其主要組成元素是C、H、N、O等，這些元素原子序數(shù)低，散射電子能力較弱，與作為背景的碳支持膜之間襯度差異很小，導(dǎo)致其信噪比較低，拍出來(lái)的照片對(duì)比度小，而且樣品易受輻照損傷，難以直接用電鏡觀測(cè)。通常要用染色的方法來(lái)增加圖像的襯度。

負(fù)染色技術(shù)最早于1959 年由Brenner 等提出［5-6］。與傳統(tǒng)的正染不同的是，樣品進(jìn)行負(fù)染時(shí)，樣品與染液之間不發(fā)生反應(yīng)，故樣品本身并不著色。利用樣品與染色劑密度的懸殊對(duì)比，在電子致密的黑色背景中能反襯出低電子密度的白色樣品，形成負(fù)反差，故稱其為負(fù)染色［7］。負(fù)染色技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、快速方便，可較好的保存樣品結(jié)構(gòu)，使被染樣品反差適中、分辨率高，且樣品與染液用量少等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于病毒、蛋白質(zhì)晶體、高分子聚合物等的分析［8］，是一項(xiàng)十分重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。但是，由于染色效果與染色劑的成分、濃度、pH值、染色方式、染液用量、染色時(shí)間等息息相關(guān)，染色效果具有一定的隨機(jī)性，常常需要多次嘗試才能獲得理想的染色效果。為了達(dá)到更好的實(shí)驗(yàn)效果，不斷有人就電子染色的方法進(jìn)行研究和改進(jìn)［9-14］。

在提高染色效果的同時(shí)，還有通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒?，不用染色，直接觀測(cè)到樣品。如周劍鋒等［15］提出了一種無(wú)需染色的“負(fù)像法”表征聚丙烯酸酯類乳膠的方法。該方法基于丙烯酸酯類聚合物熱黏、冷脆的結(jié)構(gòu)特性，通過(guò)短時(shí)烘烤，直接獲得了樣品類似負(fù)染效果的電鏡圖片，方便、快捷，同時(shí)避免了負(fù)染過(guò)程中可能引入的假象。Kraft等［16］采用金膠體修飾樣品表面，通過(guò)觀察金勾勒出的輪廓，直接觀察到脂肪酸微凝膠的形貌。王素麗［17］利用計(jì)算機(jī)算法，減少圖像中噪聲的影響，增強(qiáng)反差，提高圖像的襯度。另外，新的電鏡技術(shù)冷凍電鏡技術(shù)（Cryo-EM），可以將樣品包埋在玻璃態(tài)冰中，觀察到親水生物材料在近乎自然狀態(tài)下的形貌，減少了染色過(guò)程中引入的假象。

本文從調(diào)節(jié)染色條件的最常見(jiàn)的染液選擇、碳支持膜的處理、樣品濃度、染色時(shí)間出發(fā)，研究不同條件下可能出現(xiàn)的一些現(xiàn)象，從而有針對(duì)性地調(diào)節(jié)染色條件，為有效利用TEM 表征生物納米材料提供參考依據(jù)，得到更真實(shí)可靠、滿足分析要求的高質(zhì)量照片。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與設(shè)備

試劑：脂質(zhì)體（Drmercola），磷鎢酸（北京中鏡科儀），醋酸雙氧鈾（Electron Microscopy Sciences）。

儀器：輝光放電儀（ELCO easiGlowTMGlow Discharge，Ted Pella，USA），場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（TECNAI G2，F(xiàn)EI，USA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

脂質(zhì)體分散液的配制：稱取1 g脂質(zhì)體，加入9 mL雙蒸水后，超聲20 min 使充分分散，用濾膜過(guò)濾后待用。

醋酸雙氧鈾染液的配制：稱取1 g醋酸鈾晶體，加入99 mL雙蒸水后，在黑暗中放置30 min，充分溶解后用濾膜過(guò)濾，得到1%的醋酸鈾水溶液，放在棕色瓶中待用。

負(fù)染操作的主要步驟如圖1 所示。將適合濃度的脂質(zhì)體樣品溶液滴在碳支持膜上，停留一段時(shí)間后用濾紙將多余溶液吸除，再滴加去離子水洗漂洗，用濾紙吸干，并迅速滴上染液，使染液與支持膜上的樣品顆粒充分接觸，然后用濾紙將多余染液吸除，將樣品室溫干燥待用。

圖1 負(fù)染基本流程圖

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 不同染液對(duì)染色的影響

分別用1%濃度的醋酸雙氧鈾和磷鎢酸對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行染色，尋找合適的區(qū)域拍照，得到結(jié)果如圖2 所示。用醋酸雙氧鈾與磷鎢酸染色都可以在樣品上找到背景為黑色，顆粒為白色的區(qū)域，顆粒輪廓清晰，反差明顯，兩種染液都能獲得較好的染色效果。磷鎢酸染色的樣品，碳膜上染色區(qū)域染液沉積厚度過(guò)渡較平緩，碳膜完整；用醋酸雙氧鈾染色的樣品，染色區(qū)域較多，對(duì)比度較明顯，但碳支持膜易破裂。醋酸雙氧鈾溶液見(jiàn)光易分解［18］，不易保存，需要現(xiàn)用現(xiàn)配，具有一定的放射性和毒性，且試劑價(jià)格昂貴。磷鎢酸染液配制簡(jiǎn)便，易于存儲(chǔ)。在染色效果差不多的情況下，采用磷鎢酸溶液進(jìn)行染色。

圖2 不同染液染色后的TEM圖

2.2 碳膜處理方式對(duì)染色的影響

將磷鎢酸水溶液直接滴在碳支持膜上，在染色區(qū)域可以看到如圖3（a）所示的白色顆粒。由圖3（a）可見(jiàn)，即使是沒(méi)有樣品的銅網(wǎng)，經(jīng)過(guò)染色，也會(huì)出現(xiàn)大量的白色球形顆粒。這些顆粒，可能是染液和碳膜表面接觸在碳膜上形成的納米氣泡。研究表明，在固液界面之間，有納米氣泡存在［19-21］且納米氣泡主要在疏水表面富集。長(zhǎng)時(shí)間放置在空氣中的碳支持膜，就是一個(gè)光滑的疏水表面，當(dāng)磷鎢酸水溶液滴在上面時(shí)，在碳-水界面上很可能聚集一些納米氣泡，即圖3（a）所觀察到的白色顆粒。這種白色球形顆粒，與很多生物納米材料經(jīng)染色后的形貌非常相似，極易與樣品混淆，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)盡量避免。把碳支持膜放入輝光放電儀放電30 s后，再滴加磷鎢酸水溶液，觀察銅網(wǎng)，可以看到染色區(qū)域中的白色顆粒大大減少，如圖3（b）所示。該結(jié)果說(shuō)明，增加碳支持膜的親水性，可以減少這種假象的產(chǎn)生。在碳支持膜上先滴一滴乙醇溶液潤(rùn)濕，再滴加磷鎢酸水溶液進(jìn)行染色，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，染色區(qū)域白色顆粒也明顯減少，如圖3（c）所示。用輝光放電或者乙醇潤(rùn)濕，都能增加碳膜的親水性，減少在納米氣泡在碳膜表面的聚集，從而減少在染色過(guò)程中出現(xiàn)白色球形顆粒。因此，滴加樣品前，最好對(duì)碳支持膜進(jìn)行親水化處理，避免一些因?yàn)榻缑鏆馀荻a(chǎn)生的假象。同時(shí)，對(duì)于分散在水溶液中的納米生物材料樣品，碳膜親水化處理也能幫助樣品更均勻地分散在支持膜上。

圖3 不同碳膜處理方式染色后的TEM圖

2.3 樣品濃度對(duì)染色的影響

將濃度為1%的維C脂質(zhì)體分散液滴在碳支持膜上，用磷鎢酸染色后，形貌如圖4（a）所示，樣品形貌非常雜亂，看不出顆粒的具體形態(tài)。可能是樣品濃度過(guò)高，顆粒難以有效分散，在碳膜上團(tuán)聚堆疊，染液無(wú)法與樣品充分接觸，染色后選擇性地顯示出部分輪廓線，無(wú)法觀察到樣品的真實(shí)形貌。稀釋10 倍以后，濃度為0.1%的脂質(zhì)體分散液染色后形貌如圖4（b）所示，樣品分散較好，較少發(fā)生變形，顆粒輪廓清晰，數(shù)量較多，分布適宜，由圖像可以分析脂質(zhì)體的形態(tài)、粒徑大小及分布狀況。稀釋100 倍以后，濃度為0.01%的脂質(zhì)體分散液染色后形貌如圖4（c）所示，樣品分散好，顆粒輪廓清晰，但是數(shù)量很少，一個(gè)視野下只能找到幾個(gè)顆粒，沒(méi)有代表性。樣品過(guò)稀，沉積在支持膜上的樣品數(shù)量過(guò)少，無(wú)法在一個(gè)視野中獲得足夠數(shù)量的顆粒，這就導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)隨機(jī)性太高，對(duì)形貌與粒徑分布分析缺乏代表性和說(shuō)服力，而且加大電鏡拍照尋找顆粒的難度。不同的樣品所需要的濃度是不一樣的，這與樣品顆粒的粒徑大小、表面電荷、分散性等都有關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)中針對(duì)具體的樣品可根據(jù)拍攝情況進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

圖4 不同濃度樣品染色后的TEM圖

2.4 染色時(shí)間對(duì)染色的影響

染色時(shí)間過(guò)短，在銅網(wǎng)上只能找到很少的染色區(qū)域，可供觀察的區(qū)域很少，染色區(qū)域沒(méi)連續(xù)的黑色背景區(qū)域，只在顆粒附近有很淡的灰色，染色效果有點(diǎn)類似于“正染”，很多顆粒未顯示出來(lái)，一個(gè)視野中看到的顆粒過(guò)少，如圖5（a）所示。染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，染液沉積過(guò)厚，碳支持膜多處破裂，可供觀察區(qū)域也少，且碳膜破裂引起碳膜卷曲，引起顆粒變形，影響觀察的真實(shí)性，如圖5（c）所示。同時(shí)，過(guò)厚的染液沉積也會(huì)模糊顆粒邊界，使圖片不清晰。適當(dāng)?shù)娜旧珪r(shí)間，才能獲得合適的染色區(qū)域，得到襯度明顯，輪廓清晰的電鏡圖片，如圖5（b）所示。

圖5 不同染色時(shí)間染色后的TEM圖

3 結(jié) 語(yǔ)

1%濃度的醋酸雙氧鈾和磷鎢酸染液都能對(duì)脂質(zhì)體染色，獲得較好的染色效果。對(duì)碳膜進(jìn)行親水化處理可以避免一些因?yàn)榻缑鏆馀荻a(chǎn)生假象的同時(shí)，讓樣品能更好地在支持膜上分散。適合的樣品濃度，才能獲得理想的樣品分布；適當(dāng)?shù)娜旧珪r(shí)間，才能獲得合適的染色區(qū)域，得到襯度明顯，輪廓清晰的電鏡圖片。