張方亮 郭運生 武玉 宣斌 張浩

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是胃腸道中較為常見的惡性腫瘤，早期無明顯癥狀，隨著腫瘤的增大，患者可表現(xiàn)出排便習慣改變、便血、腹痛等癥狀，晚期則可表現(xiàn)出貧血、體重減輕等全身癥狀。其發(fā)病率和病死率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌[1]。近幾十年來，CRC的診斷和治療有了很大的進步，早期CRC可以通過手術根治，但因其起病隱匿，多數患者發(fā)現(xiàn)時已是癌癥的中晚期，手術切除不能完全根治癌癥，化療藥起到了極為重要的作用，通過輔助化療藥物治療可以延長患者的生存期，而且在某種程度上可以改善患者的生活質量。雖然NCCN(National Comprehensive Cancer Network)指南推薦,對于轉移性結直腸癌，可使用奧沙利鉑(oxaliplatin，L-OHP)聯(lián)合其他藥物[2]，但是由于腫瘤細胞基因容易產生變異，會對化療藥物產生耐藥性，導致結直腸癌對化療藥物的敏感性下降。腫瘤細胞的耐藥性是影響結直腸癌化療療效并導致化療失效的關鍵所在。因此研究和認識CRC細胞的耐藥性機制對于逆轉耐藥和減少耐藥性地產生，提高化療效果至關重要。MicroRNA(miRNA)是一類由內源基因編碼的單鏈非編碼RNA，其長度約為22個核苷酸，其在調控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥中發(fā)揮了重要的作用[3]。其中，miR-122在甲狀腺癌、食管癌、非小細胞肺癌中，能抑制原發(fā)腫瘤生長，然而在T淋巴細胞瘤、垂體瘤和白血病等腫瘤可作為潛在的促癌因子，其高表達可以促進腫瘤進展，并誘導腫瘤的耐藥性[4,5]。本研究擬探研究miR-122在結直腸癌細胞對奧沙利鉑耐藥中的影響，可為提高CRC對奧沙利鉑化療的敏感性提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 結直腸癌細胞株(SW620)均購自美國ATCC(American type culture collection)。收集秦皇島第一醫(yī)院確診的結直腸癌患者對奧沙利鉑化療敏感的癌組織(敏感組)、對奧沙利鉑化療耐藥的癌組織(耐藥組)和癌旁的正常粘膜組織(對照組)。所取標本分成2份：(1)常規(guī)病理學檢查；(2)-80℃冰箱儲存。所有標本在患者悉知并同期的情況下，并由秦皇島第一醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 組織標本RNA提取:取大小適中的結直腸癌組織標本研磨至勻漿，加入1 ml Trizol，裂解15 min后轉移至1.5 ml的EP管中，加入200 μl的氯仿后震蕩(15 s)、靜置(5 min)、離心(4℃、13 000 r/min、15 min)。收集上清，加入等體積的異丙醇混勻后靜置(10 min)、離心(4℃、13 000 r/min、10 min)、棄去上清液。加入75%的乙醇混勻、離心(4℃、13 000 r/min、5 min)、棄去上清液。待乙醇揮發(fā)完全后，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 qRT-PCR 檢測miR-122在耐藥和敏感的結直腸癌組織中的相對表達量:提取組織總的RNA,分光光度計測定 RNA濃度及純度后按照反轉錄試劑盒說明進行反轉錄。反應條件為:預變性(95℃、10 min)，變性(95℃、30 s)，復性(55℃、30 s)，延伸(72℃、1 min),總共進行40個循環(huán)。反應完成后，采用 2-ΔΔCT方法來計算分析目的基因的相對表達量及差異。見表1。

表1 引物序列

1.2.3 細胞轉染及qRT-PCR鑒定轉染效率：接種SW620細胞按照每孔2×105個細胞接種到 6 孔板上，放入培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng)。當細胞密度達到80%時，進行轉染。以無血清無雙抗Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋miR-122后，輕輕吹打后室溫下孵育5 min。加入轉染試劑輕輕吹打混勻，室溫下孵育10 min。在6孔板的每個小孔中加入轉染復合物，輕輕振蕩混勻，在 37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),5～6 h后更換新的培養(yǎng)基。轉染后48 h后提取細胞總的RNA，分光光度計測定RNA濃度及純度后根據反轉錄試劑盒說明進行反轉錄，條件為:反轉錄(37℃、1 h，)，滅活反轉錄酶(85℃、5 min)。反轉錄后進行擴增， 擴增條件為:預變性(95℃、30 s)， 變性(95℃、5 s)，延伸(60℃、30 s)，共40個循環(huán)。

1.2.4 MTT 法檢測細胞活性:取對數生長期的細胞，用0.25%胰酶進行消化、離心(500 r/min,3 min)、棄去上清液、PBS重懸洗滌(共2次)，以無血清L-15培養(yǎng)基重懸細胞，稀釋濃度至1×106 cells/ml可進行奧沙利鉑(母液5 mg/ml)加藥。將實驗分對照組(SW620)、奧沙利鉑組(SW620+奧沙利鉑)、奧沙利鉑/miR-NC組(SW620+miR-NC+奧沙利鉑)、奧沙利鉑/miR-122組(SW620+ miR-122+奧沙利鉑)，加入等量的無血清培養(yǎng)液作為陰性對照組。各組細胞密度達到5×105 cells/ml，加藥組奧沙利鉑終濃度為50 μg/ml；分別在培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng) 1 d、2 d、3 d 3個時間梯度。細胞培養(yǎng)完成后，每孔加入10 μl 的 MTT液(5 mg/ml)，在 37℃下孵育4 h后終止培養(yǎng)，并移除孔中的 MTT 液。每孔加入150 μl二甲基亞砜，放置搖床振蕩10 min。酶聯(lián)免疫檢測儀(570 nm波長)檢測，測定并記錄每孔的 OD 值。

1.2.5 Tran-swell檢測細胞侵襲:按照每孔在Transwell 上室加入200 μl上述加藥后的細胞懸液，下室加入500 μl培養(yǎng)基(含有10% FBS )，放入細胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、48 h)中培養(yǎng)。吸走小室內培養(yǎng)基后PBS洗滌；在下室內加入多聚甲醛(4%、600 μl)固定細胞30 min后吸棄固定液，在下室中加入結晶紫(0.1%、600 μl)染色20 min后棄染色液；再用PBS洗滌后，用棉簽擦掉小室內側的細胞，自然晾干，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞周期:將上述加藥后的各組細胞在培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng)24 h；使用0.25%的胰酶消化細胞后，將細胞移至1.5 ml EP管內離心(4℃、1 000 r/min、5 min)；棄上清，加入1 ml PBS洗1次后離心(4℃、1 000 r/min、5 min)，棄上清，加入1 ml 70%乙醇，輕輕混勻，在4℃下固定過夜；棄乙醇，PBS洗3次后離心(4℃、1 000 r/min、5 min)，加入PI 染液(600 μl/孔)，輕輕混勻后檢測。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測耐藥和敏感結直腸癌蠟塊組織miR-122相對表達量 qRT-PCR檢測耐藥和敏感結直腸癌組織miR-122相對表達量我們使用了18例組織，2例結直腸癌旁正常的組織，8例對奧沙利鉑耐藥的結直腸癌組織，8例對奧沙利鉑敏感的結直腸癌組織。qRT-PCR檢測結果顯示:對奧沙利鉑耐藥的結直腸癌組織的miR-122的相對表達量比結直腸癌旁正常組織高(P<0.01)，對奧沙利鉑敏感的結直腸癌組織的miR-122的相對表達量比結直腸癌旁正常組織低(P<0.01)，表明miR-122可能降低結直腸癌對奧沙利鉑的敏感性。見表1。

2.2 qRT-PCR檢測miR-122轉染效率 qRT-PCR檢測結果顯示：SW620細胞轉染miR-122mimics后，miR-122的表達量升高(P<0.01)，說明轉染成功。見表2。

表1 qRT-PCR檢測耐藥和敏感的結直腸癌組織miR-122相對表達量

表2 qRT-PCR檢測miR-122轉染效率

2.3 MTT法檢測miR-122對細胞活性的影響 MTT法結果顯示，相比于奧沙利鉑/miR-NC組，上調miR-122后，SW620細胞的活性增高(P<0.01),而且其活力隨時間呈遞增趨勢，表明miR-122能夠增加SW620細胞的活性。見表3。

表3 MTT法檢測miR-122對細胞活性的影響

2.4 Transwell法檢測miR-122對細胞侵襲力的影響 Transwell實驗結果顯示，相比于奧沙利鉑/miR-122組，上調miR-122后，增加了SW620細胞的侵襲能力(P<0.01)，表明miR-122能夠增加SW620細胞的侵襲能力。見表4，圖1。

表4 Transwell法檢測miR-122對細胞侵襲力的影響

對照組奧沙利鉑組奧沙利鉑/miR-NC奧沙利鉑/miR-122

2.5 流式細胞術檢測miR-122對耐藥株細胞周期的影響 流式細胞術結果顯示，與對照組相比，奧沙利鉑組S期所占比例增加(P<0.05)，說明奧沙利鉑將細胞阻滯在S期，與奧沙利鉑/miR-NC組相比，上調miR-122后，改變了結直腸癌細胞的細胞周期，S期所占比例減少，G2/M期所占比例增加(P<0.05)，表明miR-122改變了奧沙利鉑的S期阻滯，推進了腫瘤細胞的周期進程。見表5。

3 討論

據2018年全球癌癥數據統(tǒng)計，結直腸癌的發(fā)病率和死亡率分別位占10.2%和9.2%[6]。結直腸癌的早期無明顯癥狀，這導致患者的疾病早期診斷率較低，當患者表現(xiàn)出貧血、體重減輕等全身癥狀時，疾病已達到中晚期，這導致患者的5年生存率大大降低，僅有約10%，因此化療藥物成為治療晚期結直腸癌患者的主要手段。1999年，奧沙利鉑的原研藥在中國上市，開

表5 流式細胞術檢測miR-122對耐藥株細胞周期的影響

啟了第三代鉑類藥物在中國的應用，并迅速成為結直腸癌治療的基石藥物。奧沙利鉑的上市給腸癌患者的長期生存帶來了極大的改善，結直腸癌患者五年生存率提升了約10%，其主要是通過鉑-DNA復合物，破壞DNA的正常結構，從而抑制DNA復制和轉錄，進而誘導腫瘤細胞凋亡[7]。然而，其耐藥現(xiàn)象卻越發(fā)明顯，導致部分晚期結直腸癌的患者化療有效率低，預后差。結直腸癌對奧沙利鉑耐藥產生的機制十分復雜，包括通過增加奧沙利鉑外排、上調耐藥基因或蛋白表達、增強腫瘤細胞的自噬能力、加強DNA修復等[8]。全面深入研宄和闡明結直腸癌對奧沙利鉑耐藥的機制，將對改善結直腸癌患者的預后有極大的獲益。

MiRNA是18-24個核苷酸組成的內源性單鏈非編碼RNA，miRNA通過與靶mRNA的3’非編碼(3’UTR)結合，可以在轉錄后水平抑制靶基因的表達，導致mRNA翻譯抑制或降解，發(fā)揮不可代替的生物學作用。研究表明，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、凋亡、轉移及耐藥都密切相關[3]。研究表表明，過表達的miR-122通過負性調控PKm2，促進腎癌細胞活力、增殖、遷移和糖酵解[9]。MiR-122通過靶向LYN抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[10]。早期的CRC治療首選為手術根治性切除，但當結直腸癌出現(xiàn)轉移時，手術是不可切除的[11,12]。此時，以奧沙利鉑為基礎的化療藥物是晚期結直腸癌的一線治療。然而，由于腫瘤細胞基因容易突變，長期使用奧沙利鉑通常會降低癌細胞對奧沙利鉑的藥物敏感性，藥物耐藥性是臨床治療結直腸癌的一個主要障礙[13,14]。因此探究結直腸癌化療中奧沙利鉑耐藥性性的機制尤為重要。在我們的研究中，我們通過qRT-PCR從耐藥和敏感的結直腸癌組織中驗證miR-122的表達增加，然后我們使SW620細胞高表達miR-122，驗證高表達miR-122后，對細胞的活性、侵襲、細胞周期的影響。實驗證明，高表達miR-122后，與對照組相比，SW620細胞的活性增加，且隨時間呈遞增趨勢；細胞的侵襲能力增加；細胞周期發(fā)生S期阻滯，同時細胞的凋亡比例降低。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)miR-122在對奧沙利鉑耐藥的癌組織中表達升高，同時增加了癌細胞的活性及侵襲力，推進了細胞周期，從而降低了結直腸癌對奧沙利鉑化療藥物的敏感性，這為探究 miRNA 影響結直腸癌對奧沙利鉑耐藥提供了一個新的理論依據,為逆轉結直腸癌奧沙利鉑耐藥提供新的可能靶點。然而，不足的是我們需要進一步研究miR-122在降低結直腸癌對奧沙利鉑化療敏感性中的機制。