丁秀麗 祁秀麗 王譽(yù)霖

阿爾茨海默病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴(yán)重威脅著人們的生命健康和生活質(zhì)量，這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與炎癥關(guān)系密切[1]。星形膠質(zhì)細(xì)胞具有營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元、支持神經(jīng)元、免疫調(diào)節(jié)以及信號(hào)傳遞的作用，其是膠質(zhì)細(xì)胞中分布最廣泛、體積最大的一類細(xì)胞[2]。研究顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)有關(guān)，并且這些基因可能是改善炎癥的重要靶標(biāo)[3]。miRNA是在真核生物體內(nèi)具有多種生物學(xué)作用的非編碼RNA，其沒(méi)有開(kāi)放閱讀框，大小約為22個(gè)核苷酸，參與調(diào)控細(xì)胞分化、衰老、代謝等過(guò)程[4]。miRNA能夠通過(guò)影響下游靶基因的表達(dá)影響多個(gè)病理、生理過(guò)程[5]。研究報(bào)道顯示，miR-129-5p參與腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病發(fā)生[6,7]。既往的文獻(xiàn)顯示，上調(diào)miR-129-5p能夠減輕阿爾茨海默病大鼠神經(jīng)損傷，抑制炎癥發(fā)生[8]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)是一個(gè)在各種細(xì)胞中表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白，在組織損傷中發(fā)揮促進(jìn)作用，其表達(dá)上調(diào)后可以誘導(dǎo)炎癥發(fā)生[9]。在星形膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，HMGB1表達(dá)升高后細(xì)胞釋放炎性因子水平升高，HMGB1是一個(gè)促星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子[10]。本實(shí)驗(yàn)探討miR-129-5p對(duì)脂多糖(lipopolysaccharides， LPS)誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性介質(zhì)的影響和機(jī)制，為臨床上靶向基因抑制神經(jīng)性炎癥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 出生2 d的SD大鼠由遼陽(yáng)森科生物工程有限公司提供；HMGB1抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTex；miR-129-5p mimics和mimics control由百奧邁科生物技術(shù)有限公司構(gòu)建；引物由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成；LPS購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；IL-6檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；IL-1β檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海紀(jì)寧酶聯(lián)科技有限公司；TNF-α檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；WT和MUT由上?？殿伾锟萍加邢薰緲?gòu)建。

1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下取大鼠大腦皮層組織，放在含有D-Hanks液的培養(yǎng)液皿內(nèi)，在顯微鏡下取出腦膜、血管組織并棄掉，收集大腦皮層組織，用D-Hanks液洗滌2次。用眼科剪把大腦皮層組織剪碎成大小約為1 mm3的組織塊，在組織中添加0.125%的胰蛋白酶，放在37℃消化。用200目的網(wǎng)篩過(guò)濾，在4℃，3 000 r/min離心5 min，將上清溶液棄掉，將細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，種植到細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，細(xì)胞接種密度為6×104個(gè)/cm2，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，9 d后，將細(xì)胞放在37℃的恒溫振蕩器上，以260 r/min結(jié)合18 h。將脫落的細(xì)胞棄掉，此時(shí)貼壁的細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞。以0.25%的胰蛋白酶消化傳代，種植到細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組處理 星形膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimics和mimics control，細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法完全按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimics和mimics control后的星形膠質(zhì)細(xì)胞以含有1 μg/ml的LPS細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，記為miR-129-5p+LPS和miR-NC+LPS組。以沒(méi)有轉(zhuǎn)染的星形膠質(zhì)細(xì)胞用含有1 μg/ml的LPS細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為L(zhǎng)PS組。以沒(méi)有處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞作為空白對(duì)照，記為Control組。

1.4 miR-129-5p表達(dá)檢測(cè) 用qRT-PCR方法測(cè)定miR-129-5p表達(dá)，步驟如下：收集培養(yǎng)1 d以后的Control、LPS、miR-NC+LPS、miR-129-5p+LPS組細(xì)胞，在細(xì)胞中添加TRizol試劑，提取細(xì)胞總RNA，以NanoDrop檢測(cè)RNA樣品的濃度和純度。配制反轉(zhuǎn)錄體系：1 μl的dT primer、2 μg的RNA、2 μl的Random primer，補(bǔ)足DEPC水至13 μl，放在70℃孵育10 min，放在冰上靜置5 min，然后再添加2 μl的dNTP、4 μl的RT-buffer、0.5 μl的RTase、0.5 μl的inhibitor，此時(shí)總體積為20 μl，放在25℃孵育10 min，50℃孵育60 min，90℃孵育5 min，4℃孵育1 min。配制PCR體系，包括：0.5 μl的上下游引物、1 μl的cDNA、10 μl的LightCycler 480 SYBR GreenI，添加DEPC水至20 μl。PCR引物為：miR-129-5p F:5’-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-3’，R:5’-AAGCCCAGACCGCAAAAAGUU-3’；U6 F:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。U6為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計(jì)算miR-129-5p表達(dá)水平。

1.5 IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平檢測(cè) 收集培養(yǎng)1 d以后的Control、LPS、miR-NC+LPS、miR-129-5p+LPS組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，以ELISA法測(cè)定IL-6、IL-1β、TNF-α水平，步驟完全按照IL-6檢測(cè)試劑盒、IL-1β檢測(cè)試劑盒、TNF-α檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行；以Griess法檢測(cè)NO水平，步驟完全按照NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.6 miR-129-5p靶基因預(yù)測(cè)和鑒定 利用生物信息學(xué)軟件(targetscan)預(yù)測(cè)miR-129-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-129-5p和HMGB1的3’UTR端有結(jié)合位點(diǎn)。以熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定二者的靶向關(guān)系：將WT、MUT分別與miR-129-5p mimics、mimics control共轉(zhuǎn)染到星形膠質(zhì)細(xì)胞中，培養(yǎng)1 d，以熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶活性變化。WT、MUT分別為野生型(含有HMGB1的3’UTR端結(jié)合位點(diǎn))、突變型(含有突變HMGB1的3’UTR端結(jié)合位點(diǎn))熒光素酶報(bào)告載體。

1.7 HMGB1蛋白表達(dá)檢測(cè) 以Western blot方法檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá)，步驟如下：收集培養(yǎng)1 d以后的Control、LPS、miR-NC+LPS、miR-129-5p+LPS組細(xì)胞，在細(xì)胞中添加蛋白抽提試劑，放在冰上充分裂解20 min以后，收集裂解試劑，在4℃，12 000 r/min離心10 min，吸取蛋白上清溶液，以BCA方法測(cè)定蛋白濃度。在蛋白樣品中添加5×Loading Buffer充分混合以后，放在100℃孵育15 min。在SDS-PAGE凝膠中添加30 μg蛋白樣品，SDS-PAGE凝膠采用5%的濃縮膠和10%的分離膠，設(shè)置100 V的電壓電泳，肉眼觀察染料進(jìn)入到凝膠的底部以后，停止電泳，取出凝膠。將凝膠放在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡10 min。轉(zhuǎn)膜電壓設(shè)置為70 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為40 min，轉(zhuǎn)膜裝置放在冰上進(jìn)行。取出NC膜，以5%的脫脂奶粉封閉以后，放在1∶1 000稀釋以后的一抗反應(yīng)液中，在4℃的環(huán)境中孵育過(guò)夜，然后將NC膜放在1∶4 000稀釋以后的二抗溶液中，放在室溫中結(jié)合2 h。在NC膜上滴加ECL顯色試劑。β-actin作為參照，分析HMGB1蛋白表達(dá)變化。

1.8 HMGB1對(duì)miR-129-5p影響細(xì)胞炎性介質(zhì)釋放的作用檢測(cè) 分別將miR-129-5p mimics、pcDNA3.1和miR-129-5p mimics、pcDNA3.1-HMGB1共轉(zhuǎn)染到星形膠質(zhì)細(xì)胞中，然后以1 μg/ml的LPS細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為miR-129-5p+NC+LPS組和miR-129-5p+HMGB1+LPS組，按照1.5中方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平，按照1.7中方法檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 miR-129-5p mimics提高LPS條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)水平 LPS組細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)水平低于Control組(P<0.05)；miR-129-5p+LPS組細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)水平高于miR-NC+LPS組(P<0.05)。miR-129-5p mimics提高LPS條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)水平。見(jiàn)表1。

表1 miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染后LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)水平

2.2 miR-129-5p mimics抑制LPS條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性介質(zhì)釋放 LPS組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平高于Control組(P<0.05)；miR-129-5p+LPS組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平低于miR-NC+LPS組(P<0.05)。miR-129-5p mimics抑制LPS條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性介質(zhì)釋放。見(jiàn)表2。

表2 miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染后LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平

2.3 miR-129-5p和HMGB1靶向關(guān)系預(yù)測(cè)和鑒定 生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)miR-129-5p和HMGB1的3’UTR端有結(jié)合位點(diǎn)。miR-129-5p mimics和WT共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性下降。miR-129-5p和HMGB1互為靶向關(guān)系。見(jiàn)圖1，表3。

圖1 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-129-5p和HMGB1靶向關(guān)系

表3 細(xì)胞熒光素酶活性

2.4 miR-129-5p mimics抑制LPS條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá) LPS組細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)水平高于Control組(P<0.05)；miR-129-5p+LPS組細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)水平低于miR-NC+LPS組(P<0.05)。miR-129-5p mimics抑制LPS條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)。見(jiàn)表4，圖2。

表4 miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染后LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中HMGB1蛋白水平

2.5 pcDNA3.1-HMGB1逆轉(zhuǎn)miR-129-5p mimics對(duì)LPS條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性介質(zhì)釋放的抑制作用 miR-129-5p+HMGB1+LPS組細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞釋放IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平均高于miR-129-5p+NC+LPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。pcDNA3.1-HMGB1逆轉(zhuǎn)miR-129-5p mimics對(duì)LPS條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性介質(zhì)釋放的抑制作用。見(jiàn)圖3，表5。

圖2 Western blot檢測(cè)miR-129-5p mimics轉(zhuǎn)染后LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)

圖3 Western blot檢測(cè)miR-129-5p mimics和pcDNA3.1-HMGB1共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)

表5 miR-129-5p mimics和pcDNA3.1-HMGB1共轉(zhuǎn)染后LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中HMGB1蛋白水平和細(xì)胞釋放IL-6、IL-1β、TNF-α、NO水平

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，其受到外界因素刺激以后可以釋放多種炎性因子，促進(jìn)炎性反應(yīng)[11]。IL-6、IL-1β、TNF-α是促炎性因子，其有調(diào)節(jié)免疫和誘導(dǎo)炎癥的作用，IL-6、IL-1β、TNF-α在多種神經(jīng)炎癥性損傷中高表達(dá)[12]。NO是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，其可以調(diào)控中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)以及突觸可塑性等有調(diào)控作用[13]。研究顯示，NO與阿爾茨海默病、帕金森綜合征等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切，NO可以作為促炎因子參與炎性反應(yīng)的病理?yè)p傷發(fā)生，如DNA破壞、蛋白激酶硝?；痆14,15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS刺激以后的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的IL-6、IL-1β、TNF-α、NO含量均升高，提示LPS刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性介質(zhì)釋放，這為我們研究miR-129-5p在星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥中的作用提供了基礎(chǔ)。

miRNA沒(méi)有開(kāi)放閱讀框，也沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)的作用，在人體內(nèi)的不同組織、不同細(xì)胞中均有表達(dá)，miRNA參與不同階段生理、病理過(guò)程，miRNA是一個(gè)重要的調(diào)控因子[16]。目前的研究表明，miRNA不僅與胚胎發(fā)育等正常生理過(guò)程有關(guān)，還與人類多種疾病進(jìn)展關(guān)系密切[17]。miRNA和人類腫瘤、肺炎、缺血再灌注損傷等發(fā)生均有關(guān)，并且miRNA還可能是疾病治療的分子靶點(diǎn)[18-20]。miRNA還參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，在缺氧復(fù)氧腦損傷、阿爾茨海默病等疾病中均發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)，miRNA還參與調(diào)控疾病的進(jìn)展[21,22]。以前的研究顯示，miR-129-5p與腫瘤、椎間盤(pán)退變等有關(guān)，miR-129-5p可能是疾病治療的靶點(diǎn)[23,24]。研究表明，miR-129-5p參與阿爾茨海默病發(fā)生，并且上調(diào)miR-129-5p能夠抑制阿爾茨海默病大鼠神經(jīng)炎癥[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS刺激以后的星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-129-5p表達(dá)水平降低，并且上調(diào)miR-129-5p后的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6、IL-1β、TNF-α、NO減少，提示上調(diào)miR-129-5p抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性介質(zhì)釋放，這與以前的研究結(jié)果相符合，均說(shuō)明miR-129-5p有抗神經(jīng)炎癥的作用。

本次實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步探討了miR-129-5p的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)miR-129-5p與HMGB1互為靶向關(guān)系，并且上調(diào)miR-129-5p可以抑制LPS條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)。HMGB1是一個(gè)非組蛋白，其膿毒癥、關(guān)節(jié)炎、肺炎等炎癥疾病中發(fā)揮作用[25]。以前的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1參與神經(jīng)炎癥發(fā)生，其在星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥中高表達(dá)，并且下調(diào)其表達(dá)可以改善炎癥[10,26]。本實(shí)驗(yàn)顯示，HMGB1可以逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-129-5p對(duì)LPS條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性介質(zhì)釋放的抑制作用，提示上調(diào)miR-129-5p通過(guò)靶向HMGB1發(fā)揮抗炎作用。

總而言之，miR-129-5p在星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥中可能發(fā)揮抑制作用，上調(diào)其表達(dá)可以通過(guò)靶向抑制HMGB1減少LPS引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性介質(zhì)釋放，這為研究神經(jīng)炎癥發(fā)生機(jī)制提供了資料，為靶向基因抑制神經(jīng)炎癥發(fā)生提供了參考方向。以后會(huì)繼續(xù)研究miR-129-5p可能的其他作用機(jī)制和下游靶向調(diào)控機(jī)制。