李修志 李加鵬

目前，外科手術(shù)仍是腫瘤治療的重要手段，但術(shù)后出現(xiàn)的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響治療的重要因素。因此，如何在圍術(shù)期抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移一直是學(xué)者們研究的重要課題。麻醉藥是手術(shù)過程中不可或缺的存在，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響逐漸引起人們的關(guān)注。七氟醚是一種廣泛應(yīng)用于實(shí)體瘤切除手術(shù)麻醉誘導(dǎo)和維持的吸入麻醉劑，在腫瘤圍手術(shù)期發(fā)揮著重要作用。大量研究顯示，七氟醚對(duì)乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和肺癌等惡性腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲等具有一定的抑制作用[1-4]。微小RNAs(miRNAs)是一類與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的小分子RNA，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。已有研究證實(shí)，七氟醚可通過調(diào)控miRNAs的表達(dá)影響結(jié)直腸癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程[5,6]。miR-34a在乳腺癌組織和細(xì)胞中異常低表達(dá)，其過表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲[7]；七氟醚被證實(shí)可通過上調(diào)miR-34a的表達(dá)抑制胃癌和結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展[8,9]，但其是否通過調(diào)控miR-34a表達(dá)影響乳腺癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展尚不清楚。本研究以乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為研究對(duì)象，通過觀察七氟醚對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中miR-34a表達(dá)的影響，探討miR-34a是否以及如何參與七氟醚抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù))，miR-34a模擬物、miR-34a抑制劑及其相應(yīng)的陰性對(duì)照miR-NC和anti-miR-NC(廣州瑞博生物)，青鏈霉素、胰酶消化液、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)，二甲基亞楓和MTT試劑(美國(guó)Sigma公司)，HMGB1單克隆抗體和β-actin 單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz 公司)，Matrigel (美國(guó)BD公司)，PVDF 膜(美國(guó)Millipore公司)，引物(上海英駿生物)，發(fā)光底物 ECL、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(碧云天生物公司)，Transwell 小室(美國(guó)Corning公司)，七氟醚揮發(fā)罐(美國(guó)Abott公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及七氟醚處理 采用含有10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞以適當(dāng)密度種植于96孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過夜。將其分為對(duì)照組、1.7%七氟醚組、3.4%七氟醚組和5.1%七氟醚組，并置于兩側(cè)壁分別裝有進(jìn)氣口和出氣口的無(wú)菌密閉的玻璃箱中，并采用麻醉機(jī)和麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀連接進(jìn)氣口和出氣口。其中對(duì)照組按照6 L/min通入5%CO2和95%O2的混合氣體處理4 h，而其余3組分別以1.7%、3.4%和5.1%七氟醚6 L/min處理4 h。各組細(xì)胞處理結(jié)束后，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h。分別采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖率，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力，Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-34a和HMGB1 mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)HMGB1蛋白的表達(dá)。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將長(zhǎng)勢(shì)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞以每孔1×104個(gè)密度種植于96孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。將其按照1.2中的分組和七氟醚處理結(jié)束后，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加入5 g/L的MTT溶液反應(yīng)4 h，再加入150 μl二甲基亞楓溶解藍(lán)紫色結(jié)晶。使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值。按照公式：細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(對(duì)照孔吸光度值-空白孔吸光度值)×100%計(jì)算各組細(xì)胞的增殖率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞按照每孔300個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板上，使細(xì)胞分布均勻后，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h。再按照1.2中的分組與處理進(jìn)行七氟醚刺激。待七氟醚刺激結(jié)束后，移入培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)14 d。取出培養(yǎng)板，吸取培養(yǎng)液后，采用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞后，分別加入1 ml 的甲醇固定和200 μl的姬姆薩染色20 min后，以自來(lái)水洗去染液后，晾干。置于顯微鏡下觀察克隆數(shù)(>50個(gè)細(xì)胞)，并以克隆數(shù)與接種細(xì)胞數(shù)的百分比表示各組細(xì)胞的克隆形成率。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞以每孔1×104個(gè)密度接種至24孔細(xì)胞板上，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過夜。根據(jù)1.2中的分組及處理給予不同濃度的七氟醚處理后，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞后，取細(xì)胞懸液(濃度為1×104個(gè)/ml)200 μl加入到 Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室上室中，而下室內(nèi)加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基500 μl。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，分別以甲醛固定和結(jié)晶紫染色15 min。使用棉簽小心除去上室內(nèi)殘留的細(xì)胞后，顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野觀察穿過微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 miR-34a和HMGB1mRNA表達(dá)的檢測(cè) 收集對(duì)照組、1.7%七氟醚組、3.4%七氟醚組和5.1%七氟醚組細(xì)胞，以Trizol法提取細(xì)胞總RNA后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以1.5 μl cDNA為模板，加入12.5 μl Master Mix、各2 μl的上下游引物和7 μl的ddH2O配成25 μl的PCR反應(yīng)體系。按照95℃ 7 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s，58℃ 30 s ，72℃ 4 min，共40個(gè)循環(huán)的反應(yīng)條件上PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以U6和β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞中miR-34a和HMGB1mRNA的表達(dá)水平。

1.7 HMGB1蛋白表達(dá)的檢測(cè) 向收集到的5.1%七氟醚組、3.4%七氟醚組、1.7%七氟醚組和對(duì)照組細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解提取總蛋白后，參照BCA蛋白檢測(cè)試劑盒步驟流程檢測(cè)總蛋白的濃度。按照1∶4比例加入5×上樣緩沖液，放入沸水中變性5 min。使用微量加樣器向SDS-PAGE凝膠中加入蛋白樣品10 μl進(jìn)行電泳分離。以轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜后，置于含5%脫脂奶粉的TBST工作液中封閉1.5 h。封閉結(jié)束后，將膜轉(zhuǎn)入一抗工作液中4℃下孵育過夜。以TBST工作液漂洗3次后，將膜放入二抗工作液中常溫孵育1 h。以ECL暗室內(nèi)顯影后，Image J圖象分析軟件分析HMGB1蛋白條帶的灰度值，并以內(nèi)參β-actin進(jìn)行校正。

1.8 實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(未處理)、七氟醚組(給予5.1%七氟醚刺激)、七氟醚+anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC后給予5.1%七氟醚刺激)和七氟醚+anti-miR-34a組(轉(zhuǎn)染miR-34a抑制劑后給予5.1%七氟醚刺激)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞以每孔1×105個(gè)密度接種至6孔細(xì)胞板上，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)，按照脂質(zhì)體2000說明書步驟將miR-34a抑制劑及其相應(yīng)對(duì)照anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至七氟醚+anti-miR-34a組和七氟醚+anti-miR-NC組細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，給予5.1%七氟醚刺激4 h。按照實(shí)驗(yàn)分組處理結(jié)束后，分別進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)miR-34a對(duì)七氟醚刺激下MDA-MB-231細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

1.9 熒光素酶實(shí)驗(yàn) TargetScanHuman軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)HMGB1 3’-UTR區(qū)域有能夠與miR-34a互補(bǔ)的核苷酸序列，猜測(cè)HMGB1可能是miR-34a的靶基因。為了驗(yàn)證兩者的靶向關(guān)系，通過構(gòu)建含HMGB1 3’-UTR序列的野生型(HMGB1-WT)和突變型(HMGB1-MUT)的熒光素酶報(bào)告載體質(zhì)粒，并參照脂質(zhì)體2000說明書步驟行miR-NC(miR-34a模擬物陰性對(duì)照)+HMGB1-WT、miR-34a(miR-34a模擬物)+HMGB1-WT、miR-NC+HMGB1-MUT、miR-34a+HMGB1-MUT 4組共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性，具體的檢測(cè)流程參照熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說明書。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 七氟醚抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和侵襲 1.7%、3.4%和5.1%濃度的七氟醚作用后MDA-MB-231細(xì)胞增殖率和克隆形成率以及侵襲細(xì)胞數(shù)均呈濃度依賴性降低，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組細(xì)胞增殖率、克隆形成率和侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.2 HMGB1是miR-34a的靶基因 HMGB1 3’ UTR存在能夠與miR-34a互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸序列。與HMGB1-WT共轉(zhuǎn)染的miR-34a組細(xì)胞的熒光素酶活性較miR-NC組顯著降低(P<0.05)，而與HMGB1-MUT共轉(zhuǎn)染的miR-34a組和miR-NC組細(xì)胞的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、3。

表2 HMGB1 3’ UTR與miR-34a的結(jié)合位點(diǎn)

表3 4組細(xì)胞熒光素酶活性的比較

2.3 七氟醚促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中miR-34a表達(dá)而抑制HMGB1表達(dá) 與對(duì)照組比較，不同濃度的七氟醚刺激后MDA-MB-231細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平顯著升高，而HMGB1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，且具有濃度依賴性。見圖1，表4。

2.4 miR-34a低表達(dá)逆轉(zhuǎn)七氟醚對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中HMGB1表達(dá)的抑制作用 與對(duì)照組比較，七氟醚刺激后MDA-MB-231細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平顯著升高，而HMGB1mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與七氟醚組比較，七氟醚+anti-miR-34a組細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平顯著降低，而HMGB1mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；然而，miR-34a和HMGB1在七氟醚+anti-miR-NC組和七氟醚組細(xì)胞中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表5。

圖1 Western blot檢測(cè)HMGB1蛋白的表達(dá)

表4 4組細(xì)胞中miR-34a、HMGB1 mRNA和HMGB1蛋白表達(dá)比較

圖2 Western blot檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá)

2.5 miR-34a低表達(dá)逆轉(zhuǎn)七氟醚對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用 與對(duì)照組比較，七

表5 4組細(xì)胞中miR-34a、HMGB1 mRNA和HMGB1蛋白表達(dá)比較

氟醚刺激后MDA-MB-231細(xì)胞的增殖率、克隆形成率和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)；與七氟醚組比較，細(xì)胞增殖率、克隆形成率和侵襲細(xì)胞數(shù)在七氟醚+anti-miR-NC組中無(wú)顯著改變(P>0.05)，但在七氟醚+anti-miR-34a組中均顯著升高(P<0.05)。見表6。

表6 4組細(xì)胞增殖率、克隆形成率和侵襲細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

乳腺癌是女性中發(fā)病率很高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的身體健康和生命安全。隨著科學(xué)界對(duì)麻醉藥研究的深入，臨床常用的麻醉藥——七氟醚對(duì)乳腺癌的影響逐漸受到關(guān)注。Xu等[10]研究指出，七氟醚可通過下調(diào)MMP-9抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移。Yao等[11]研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚可通過抑制NF-κB活性下調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)抑制乳腺癌AU565細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。另外，Liu等[12]研究指出，七氟醚可通過上調(diào)miR-203表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖?？梢?，七氟醚對(duì)乳腺癌細(xì)胞的惡性增殖和侵襲具有一定的抑制作用，但其具有的影響機(jī)制尚不完全明確。

Li等[8]在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，七氟醚減弱胃癌MGC-803細(xì)胞的黏附能力與上調(diào)miR-34a的表達(dá)有關(guān)。Shan等[9]在結(jié)直腸癌的研究中指出，miR-34a表達(dá)上調(diào)是七氟醚抑制HCT116細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的重要機(jī)制。眾所周知，miRNAs在乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色，其成員miR-34a被證實(shí)在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，而上調(diào)其表達(dá)可抑制乳腺癌胞MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和侵襲[13]。因此，猜測(cè)七氟醚是否是通過上調(diào)miR-34a表達(dá)影響乳腺癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。為了驗(yàn)證是猜想，本研究以1.7%、3.4%和5.1%七氟醚處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞4 h后發(fā)現(xiàn)，七氟醚除了可呈濃度依賴性抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖和侵襲外，還可引起miR-34a表達(dá)的升高。同時(shí)，通過轉(zhuǎn)染miR-34a抑制劑成功下調(diào)miR-34a表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，七氟醚對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用得到部分逆轉(zhuǎn)。這提示miR-34a在七氟醚抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖和侵襲過程中發(fā)揮積極作用。

HMGB1是一種高度保守的核內(nèi)非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，在宮頸癌、胃癌和肺癌等多種腫瘤組織和細(xì)胞中異常高表達(dá)，與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，可通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲等在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要促進(jìn)作用[14-16]。HMGB1在乳腺癌組織中異常高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞分化、腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)；上調(diào)其表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，而下調(diào)其表達(dá)可降低細(xì)胞的增殖與侵襲[17,18]。Chandrasekaran等[19]證實(shí)，miR-34a可通過靶向下調(diào)HMGB1抑制宮頸癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究進(jìn)一步采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-34a的靶基因，最終將HMGB1作為研究對(duì)象。HMGB1 3’ UTR區(qū)域存在與miR-34a結(jié)合的核苷酸序列，并且熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-34a可與HMGB1 3’ UTR位點(diǎn)結(jié)合降低轉(zhuǎn)染含HMGB1 3’-UTR序列的野生型(HMGB1-WT)質(zhì)粒的熒光素酶活性；同時(shí)下調(diào)miR-34a表達(dá)可引起HMGB1表達(dá)升高。這表明HMGB1是miR-34a的靶基因。Wang等[20,21]分別在肺癌和肝癌的研究中證實(shí)七氟醚可抑制HMGB1的表達(dá)。本研究以1.7%、3.4%和5.1%七氟醚處理后發(fā)現(xiàn)，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中HMGB1表達(dá)水平逐漸降低。結(jié)合前面研究表明，下調(diào)miR-34a可通過靶向上調(diào)HMGB1表達(dá)促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞增殖和侵襲，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)七氟醚對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用。結(jié)果提示，七氟醚可通過上調(diào)miR-34a表達(dá)引起HMGB1表達(dá)下降進(jìn)而減弱MDA-MB-231細(xì)胞增殖和侵襲。

綜上所述，七氟醚可通過調(diào)控miR-34a/HMGB1表達(dá)抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和侵襲。該結(jié)果進(jìn)一步豐富了七氟醚抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制，也為臨床圍術(shù)期使用七氟醚防治乳腺癌的惡性進(jìn)展提供了新線索。