李紫宣 馮志林 崔大鵬

據(jù)統(tǒng)計，PC的常見病因至今尚不十分清楚，約有90%起源于腺管上皮，由于它具有高發(fā)病率，高死亡率和低生存率等特征，在全球范圍備受關(guān)注[1]。根據(jù)美國癌癥發(fā)病情況年度報告《2020年癌癥統(tǒng)計》公布的癌癥5年相對生存率來看，PC的生存率僅占9%[2]。同時該研究還指出，僅在2020年內(nèi)，每天便約有1 600人死于癌癥。而從國內(nèi)公布的最新調(diào)查數(shù)據(jù)來看，PC的五年相對生存率僅占7.2%，發(fā)病率、死亡率均居惡性腫瘤的第10位[3]。ctDNA是一種無細胞狀態(tài)的胞外DNA，是腫瘤細胞體細胞DNA經(jīng)脫落或凋亡后釋放而進入循環(huán)系統(tǒng)的，在血液，滑膜液、腦脊液等中均可尋見其身影。雖然ctDNA的發(fā)現(xiàn)，比DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)還早6年，但對它的研究與腫瘤關(guān)聯(lián)起來的，缺相對較晚。當前所參閱的相關(guān)資料中幾乎所有種類的癌癥均可檢測到ctDNA及其所攜帶的標志性突變。據(jù)此而拓展開來的研究數(shù)據(jù)證也證實，ctDNA特有突變頻率越高，且這種現(xiàn)象與腫瘤越晚期，病情越重，腫瘤惡性程度越高呈正相關(guān)[4]。如一項針對15中癌癥所開展的ctDNA測序?qū)嶒炞C實，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期癌癥(47%、55%、69%、82%)患者的ctDNA突變頻率較其他分期的癌癥患者更高，故對其定性、定量和追蹤對癌癥的治療舉足輕重[5]。盡管如此，當前與PC相關(guān)聯(lián)的ctDNA研究與案例卻鮮有涉獵。借此，本文將通過對照試驗的方式對PC患者機體中的ctDNA表達水平進行針對性實驗，探析其表達及臨床意義。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2017年1月至2020年1月就診于腫瘤科胰腺癌患者47例。全部由病理切片明確診斷，納入與排除標準均符合《胰腺癌診治指南(2014年版)》和《胰腺癌綜合診治指南(2018年版)》[6,7]相關(guān)要求，且通過本院倫理委員會審核后執(zhí)行，簽署《知情同意書》并提取腫瘤組織做實驗標本。其中男31例，女16例；年齡52～80歲，平均年齡(64.75±5.20)歲。按美國癌癥聯(lián)合會(Alternate Joint Communications Center，AJCC)制定的TNM及病理分期系統(tǒng)(第7版)評估：T1/2期11例，T3/4期36例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：N0/1者：13例，N2/3者34例；病理分型：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑：本課題實驗部分所需的主要儀器與主要試劑的名稱、型號、生產(chǎn)廠家等常規(guī)資料如表1所述，儀器操作步驟及注意事項，試劑的操作規(guī)范、步驟及注意事項等均按具體使用說明書或根據(jù)檢測師實際需求而定。見表1。

表1 儀器與試劑

1.2.2 癌組織與癌旁組織的DNA提?。核蠵C患者的癌組織和癌旁組織取樣與手術(shù)切除后1 h內(nèi)完成，每塊組織在1 cm3左右。用PBS沖洗液(1%)沖洗后后裝于凍存管，并置于冰盒暫存，然后將其轉(zhuǎn)移至EP試管(1.5 ml)后加入氯仿(200 μl)反復(fù)顛倒(40次左右)直至混勻再離心(離心速率：12 000 G/min，離心時間：15 min，離心環(huán)境溫度：4℃)，轉(zhuǎn)移上清至EP試管(1.5 ml)后加550 μl異丙醇混勻并靜置5 min，離心(離心速率：12 000 G/min，離心時間：15 min，離心環(huán)境溫度：4℃)處理，并去上清。最后置于-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩＝又碊NA提取試劑盒操作說明書提取ctDNA大致分5步：①取樣剪碎后將其放入離心管(含20 μl蛋白酶K，離心管大?。? ml)并置于水浴鍋(溫度：56℃)中使其充分溶解。②加入適量緩沖液(200 μl)后再次將其置入水浴鍋(溫度：70℃)煎煮10 min。③將無水乙醇(200 μl)加入并混合成液，接著將其移至QIAamp Mini柱中，離心(離心速率：12 000 G/min，離心時間：15 min，離心環(huán)境溫度：4℃)并去上清。④加入適量AW1緩沖液(500 μl)再離心和去廢液，接著加入AW2緩沖液(500 μl)，再離心和去廢液。⑤取出實驗樣本后將其置入新的洗脫管內(nèi)，加入AE緩沖液(200 μl)后在溫室條件下靜置60 s，再離心，最后收集溶液和提取DNA。見表2。

1.2.3 QR-PCR檢測：取3個EP管(0.2 ml)并分別標記成β-肌動蛋白(β-actin)、SPRY-2、AEG-1，β-actin為內(nèi)參。接著將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，步驟共2步。第一步反應(yīng)體系的反轉(zhuǎn)錄儀的運行條件為70℃，反轉(zhuǎn)錄時間5 min，保存條件4℃。第一步結(jié)束后接著進行第二步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，即將40 μl體系中前5種反應(yīng)物震蕩混勻和離心(離心1 000 g，1 min)處理放置于冰上設(shè)置反轉(zhuǎn)錄儀條件(37℃條件下60 min，95℃條件下5 min)，4℃條件下恒定時將EP管置于反轉(zhuǎn)錄儀上進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Spry2、AEG-1的QR-PCR反應(yīng)：均在96孔板中進行PCR擴增。反應(yīng)結(jié)束后在此計算各反應(yīng)管的Ct值(重復(fù)實驗條件與上述相同，不贅述)，基因突變的QR-PCR檢測內(nèi)容如表4，檢測方法按QR-PCR試劑盒說明書執(zhí)行。所有病理圖像分析由≥2名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師評估，分析PC患者機體中的ctDNA在癌組織和癌旁組織中的表達。見表3。

表2 棄去上清步驟

表3 基因突變檢測項目

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件，組間配對時的T、P檢驗采用PRISM 6.0軟件處理，雙變量相關(guān)采用Spearman檢驗，兩個相關(guān)樣本、獨立樣本分別采用Wilcoxon檢驗、Mann-Whitney U檢驗，PC患者癌組織中的相對表達量為非正常分布，癌旁組織中參數(shù)表達則用非參數(shù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Kras基因G12D位點突變與PC(外周血)病理參數(shù)比較 從ctDNA檢出角度看，TNM分期(N分期)、性別、年齡等PC病理參數(shù)與Kras基因G12D位點突變無相關(guān)性(P>0.05)，CA19-9表達、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與Kras基因G12D位點突變相關(guān)(P<0.05)。從Kras突變角度看，性別、年齡、CA19-9表達等PC病理參數(shù)與G12D、G12V/R突變無顯著的相關(guān)性(P>0.05)，TNM分期、T分期、N分期與G12D、G12V/R突變相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 PC外周血ctDNA檢測Kras基因G12D位點突變與病理參數(shù)的關(guān)系 例(%)

2.2 QR-PCR檢測條件下的PC患者ctDNA判定 通過QR-PCR儀檢測結(jié)果所繪制的ctDNA的Kras基因的G12D、G12V和G12R位點上的突變型和野生型典型結(jié)果來看，檢測結(jié)果是符合該檢測技術(shù)的高敏感度(0.001%)和Taqman探針的強特異性的。其中圖1-a中的熒光探針信號強度能有效的將突變型、野生型信號區(qū)別出來；而圖1-b證實此次的ctDNA擴增可分成四個象限，即無擴增、野生+突變、突變型和野生型，并獲得其各自的拷貝數(shù)。納入47例PC患者血漿中含有KrasG12D位點突變亞型者共9例(19.15%)，G12V位點突變亞型共3例(6.38%)，無任何G12R位點突變被檢測出來，其余的統(tǒng)稱野生型突變。見圖1。

2.3 PC患者總體生存時間與ctDNA及Kras(G12D)位點突變的關(guān)系 通過對PC患者為期2年的隨訪數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，47例PC患者中有21例處于Kras突變狀態(tài)，包括Ⅰ～Ⅱ期的有7例存在ctDNA表達，Ⅲ～Ⅳ期的14例存在ctDNA表達，野生型Kras基因組的總生存時間顯著高于突變組(P<0.05)。見表5。

圖1 QR-PCR檢測的ctDNA突變型和野生型的典型結(jié)果圖

表5 PC患者總體生存時間與ctDNA及Kras(G12D)位點突變的關(guān)系

2.4 PC患者ctDNA表達與CTC增殖關(guān)系 Cell Counting Kit-8細胞計數(shù)試劑(CCK-8)法檢測發(fā)現(xiàn)，循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)增殖能力上調(diào)與ctDNA表達上調(diào)呈正比(P<0.05)。見圖2。

圖2 ctDNA表達與PC細胞增殖的關(guān)系

2.5 影響PC患者總生存時間的危險因素分析 將文中P<0.05的各指標納入多因素Cox風(fēng)險比例回歸分析，年齡≥65歲、CA19-9≥182 U/ml均不是影響PC患者總生存時間的危險因素(P>0.05)，而ctDNA呈陽性、TNM Ⅲ～Ⅳ期、CTC增殖均是影響PC患者總生存時間的獨立危險因素(P<0.05)。見表6。

表6 PC患者的總生存時間的Cox比例風(fēng)險回歸分析

2.6 PC患者的總生存時間的影響因素判斷價值 通過Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，PC患者總生存時間與CTC增殖、ctDNA、TNM Ⅲ～Ⅳ期的關(guān)系密切(Log-rank檢驗，P分別=0.027、0.015、0.006，P<0.05)。見圖3。

圖3 PC患者的總生存時間的影響因素判斷價值

3 討論

已有相關(guān)研究證實，血漿或血清中游離的ctDNA與PC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)已被初步論證[8]。早期診斷困難，是導(dǎo)致PC患者術(shù)后總體生存時間偏低的關(guān)鍵因素之一，而結(jié)合當前實際情況來看，在PC早期診斷中，有機會實施手術(shù)切除者僅占15%～20%，而手術(shù)方法作為唯一的、可治愈PC的方法，其臨床療效的好壞，又由諸多因素構(gòu)成。因此，為提高PC總體預(yù)后，提高該病的臨床診斷水平和對其腫瘤病變、增殖、轉(zhuǎn)移機制進行針對性研究無疑十分必要。從既往研究來看，大量研究數(shù)據(jù)已證實CTC在PC早期診斷和預(yù)后判斷中有不可替代的作用[9]，故拓展以ctDNA為代表的新型PC生物標志物研究途徑無疑具有舉足輕重的現(xiàn)實意義，這也是本課題為之順利推進的基礎(chǔ)。

脫氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid，DNA)是由脫氧核苷酸(堿基、脫氧核糖和磷酸構(gòu)成)組成的一種大分子聚合物，是生物細胞內(nèi)含有的四種生物大分子核酸之一，包括單鏈DNA、閉環(huán)DNA和垃圾DNA三種。DNA是引導(dǎo)生物發(fā)育與生命機能運作的關(guān)鍵，與基因的關(guān)系十分密切，即基因是有效遺傳的DNA片段。有人形象的將ctDNA比作腫瘤細胞留在血液中的指紋，故追查癌癥的真兇，分析癌癥的各項特征，并以此為基礎(chǔ)抑制癌癥細胞病變、增殖、轉(zhuǎn)移，甚至清除癌癥細胞，弄清ctDNA極其關(guān)鍵，因為ctDNA特有突變評率的高低與腫瘤的分期、病情嚴重程度及腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。PC是一種相對常見、多發(fā)的消化系統(tǒng)腫瘤，占據(jù)其50%，且無論是國內(nèi)，還是國外，PC的發(fā)病率、死亡率均呈現(xiàn)遞增態(tài)勢[10]。腫瘤細胞是ctDNA來源的關(guān)鍵，早在1994年，有科學(xué)家在cfDNA中檢測到了Kras基因突變。而近年來的諸多研究證實，突變、插入、缺失、重排、拷貝數(shù)異常和甲基化等都是ctDNA所攜帶的特有的變異特征[11,12]。值得注意的是，由于ctDNA片段大小不等，較非腫瘤性cfDNA更大，再加上它受腫瘤負荷大小、腫瘤狀態(tài)、DNA清除劑降解機制等多種因素的影響，因此想要找到它絕非易事。

本文通過QR-PCR儀檢測結(jié)果繪制了ctDNA的Kras基因的G12D、G12V和G12R位點上的突變型和野生型的熒光信號圖，并在此基礎(chǔ)上通過微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)獲得了其單元總數(shù)、熒光信號單元數(shù)及樣品稀釋系數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本文檢測結(jié)果符合檢測操作的高敏感度(0.001%)和Taqman探針強特異性。其中圖1-a主要區(qū)別出來的是突變型、野生型信號，圖1-b獲得的是ctDNA擴增的四個象限，包括無擴增、野生+突變、突變型和野生型四種，并由此而上述四個象限的各自的拷貝數(shù)，這與既往研究結(jié)果接近[13]。而從文中納入的47例PC患者的檢測結(jié)果來看，有9例PC患者的血漿中含有KrasG12D位點突變亞型，占總數(shù)的19.15%，有3例PC患者血漿中含有G12V位點突變亞型，占總數(shù)的6.38%，無任何G12R位點突變跡象。而文中KrasG12D位點突變的獲得，才是后續(xù)實驗得以鋪敘與推進的關(guān)鍵，也是佐證ctDNA表達在PC早期診治中有現(xiàn)實意義的基礎(chǔ)。在上述研究基礎(chǔ)上本文對可能影響PC患者癌組織中ctDNA表達的可能存在的危險因素進行了單因素、多因素分析，最終的Cox風(fēng)險比例回歸分析篩選確定ctDNA呈陽性、TNM Ⅲ～Ⅳ期、CTC增殖是影響PC患者總生存時間的獨立危險因素(P<0.05)。其中在PC患者的癌組織中的ctDNA表達呈陽性，提示ctDNA基因位點突變檢測可作為CA19-9檢測的輔助指標，實現(xiàn)對PC病變?nèi)^程的判定依據(jù)。但文中CA19-9表達水平與KrasG12D突變與否卻無顯著相關(guān)性(P>0.05)，原因可能來自于樣本量偏低所致，而比對既往研究來看，這是應(yīng)引起重視的。同時，管莎莎[14]對轉(zhuǎn)移性PC患者的癌組織和外周血實驗也證實，ctDNA表達存在于該病的早期診斷被檢測出來，這說明ctDNA表達極有可能存在于PC的早期病變中。此外，文中G12D位點突變同G12V/R 位點突變的OS顯著相關(guān)(P<0.05)。故將ctDNA表達作為PC的危險因素可行，而Cox風(fēng)險比例回歸分析提供的依據(jù)無疑是最好的佐證[15]。CCK-8法證實，CTC增殖能力上調(diào)與ctDNA表達上調(diào)呈正比(風(fēng)險比：4.021，1.223<95%可信區(qū)間<7.584，P<0.05)，Log-rank檢驗下的P=0.027。但ctDNA表達與CTC之間的關(guān)系還需后續(xù)提供更多依據(jù)。

綜上所述，PC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等過程與ctDNA表達水平相關(guān)。將PCR用于PC患者外周血ctDNA表達檢測有益，ctDNA呈陽性是影響PC預(yù)后不良的重要判定依據(jù)，可將其視作PC診斷的一種新型標志物。