陳先平 竇紅珍 劉慶豐 宋志東 陳康

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤，男性發(fā)病率顯著高于女性。膀胱癌具有時(shí)間上反復(fù)發(fā)作和空間上多中心性的特點(diǎn)，并且具有局部浸潤轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)率高的生物學(xué)特點(diǎn)[1]。微小RNA(miRNA)是真核生物以及某些大型病毒中存在的，長度為20～24個(gè)核苷酸的一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA。miRNA具有調(diào)節(jié)性，可與mRNA的3’UTR互補(bǔ)結(jié)合，使mRNA的翻譯被抑制或?qū)е耺RNA的穩(wěn)定性降低，從而負(fù)調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)[2]，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、分化以及凋亡等多種生物學(xué)功能[3]。miRNA表達(dá)的異常以及生物合成的紊亂是許多癌細(xì)胞的重要特征，研究表明，不同的miRNA在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮抑癌或致癌的不同功能[4]。例如miRNA-143可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力，而miRNA-15a的下調(diào)或缺失會導(dǎo)致抗凋亡基因bcl2的表達(dá)量升高，引起淋巴瘤和白血病的發(fā)生[5]。本研究通過對膀胱癌組織和T24細(xì)胞株的研究，探討miRNA-217對T24細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響及其可能的作用機(jī)制，為臨床治療膀胱癌提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年12月至2018年4月于我院接受手術(shù)治療的80例膀胱癌患者癌組織及距離癌組織超過2 cm處的正常組織，用以上組織構(gòu)建膀胱癌組織芯片。在免疫組織化學(xué)染色后有16例組織標(biāo)本出現(xiàn)不同程度缺失，其余64例標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢測證實(shí)為原發(fā)性膀胱癌，并納入研究。其中男28例，女36例；年齡40～75歲，平均年齡(54.01±6.21)歲；術(shù)前患者均未進(jìn)行放化療。所有患者同意本研究并簽署知情同意書，且經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)后收集標(biāo)本。

1.2 材料 人源膀胱癌細(xì)胞株T24購自上海博古生物技術(shù)有限公司。慢病毒過表達(dá)載體RSK4-miRNA-217、陰性對照RSK4-NC及miRNA-217、U6引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)完成。DMEM培養(yǎng)基(D777)、蛋白定量試劑盒于TOYOBO采購；Trizol reagent(9009)采購自TaKaRa；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國 Advansta、Transwell小室采購自BD；抗體購自碧云天有限公司；10～12周無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雄性 SD 大鼠，體重200～230 g，購自北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號：SYXK(京)2017-005]，裸鼠實(shí)驗(yàn)遵循動物保護(hù)和做好動物福利規(guī)定，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。蘇凈Airtech超凈工作臺；三洋 MCO-15AC細(xì)胞培養(yǎng)箱；尼康 Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡；艾本德5810R 型高速離心機(jī)；羅氏 R480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；蔡司LSM710共聚焦激光掃描顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR:采用Trizol法提取各組細(xì)胞及組織中總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)過程:①預(yù)變性：75℃，120 s；②變性：90℃，5 min；③退火：60℃，60 s；④延伸72℃，30 s；⑤PCR儀采集熒光信號40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)5 次。U6作為內(nèi)參(上游引物為5’-AACAGAGATGAGCCTTGTGC-3’，下游引物為5’-CGTACGTAGTCGAACCGAGA-3’)， 目的基因miR-217(上游引物為5’-CCATATCGCTGGATGACGAT-3’，下游引物為5’-GCCGTGGGGTGTTCAATACT-3’)，Jagged-1的mRNA(上游引物為 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為 5’AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)，目的基因相對表達(dá)量用2-ΔΔCT表示；每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)測量3次。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:將T24細(xì)胞接種于含有滅活的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件37℃，5%CO2，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)85%時(shí)，胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，調(diào)整膀胱癌T24細(xì)胞株濃度至1×106個(gè)/ml，采用Lipofectamine 2000將濃度均為100 nmol/L的RSK4-miRNA-217和RSK4-NC慢病毒載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，細(xì)胞分為RSK4-miRNA-217組、RSK4-NC組以不轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞作為空白對照組。

1.3.3 CCK-8及平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測miR-217對T24細(xì)胞增殖的影響:將各組按照每孔500～1 000個(gè)密度鋪至96 孔板，輕輕混勻后，置入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72、96 h，每孔加CCK-8 10 μl，37℃避光4 h 后，棄掉孔內(nèi)液體，再加DMSO各100 μl，置于37℃搖床上快速振蕩15 min，以便充分溶解結(jié)晶物，最后將96 孔板置于酶標(biāo)儀上檢測 450 nm 處的OD值。將上述2種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞按每孔5 000個(gè)密度鋪6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，隔周更換新鮮培養(yǎng)液，2周后用考馬斯亮藍(lán)染色，記錄菌落形成數(shù)量。

1.3.4 裸鼠皮下荷瘤模型:調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×105個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，分組處理同上，輕輕混勻后，置入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待生長密度達(dá)到1×106個(gè)/ml時(shí)，消化細(xì)胞，200 r/min離心5 min，棄掉上清液，加入500 μl PBS緩沖液，避光放置于冰上，同時(shí)備好2 ml注射器。4周雄性裸鼠，隨機(jī)分為3組，每組6只。用10%的水合氯醛將已經(jīng)禁食12 h的SD大鼠麻醉后(每組6只)，將1 ml細(xì)胞懸液注射進(jìn)裸鼠右前肢下部皮膚。接種第5天后能觀察到原位腫瘤。同時(shí)使用活體成像系統(tǒng)(IVIS)來檢測生物信號強(qiáng)度(備注：檢測前10 min，需以150 mg/kg劑量腹腔注射Luciferin)。7 d后裸鼠皮下成瘤，之后每隔3 d用游標(biāo)卡尺測1次移植瘤長徑(a)和短徑(b)，并計(jì)算腫瘤體積(V)=ab2/2，繪制腫瘤生長曲線。

1.3.5 生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-217和PI3K的關(guān)系:根據(jù)www.microRNA.org網(wǎng)站預(yù)測miR-217和PI3K的結(jié)合片段。采用PCR擴(kuò)增含有miR-217、PI3K結(jié)合位點(diǎn)的Dicer1片段，并將擴(kuò)增的該片段插入熒光素酶載體psi-CHECK中，構(gòu)建野生型質(zhì)粒psi-CHECK-PI3K-wild，同時(shí)將結(jié)合片段中的核苷酸進(jìn)行基因突變，并構(gòu)建突變型質(zhì)粒psi-CHECK-PI3K-mutant。將miR-217及陰性對照分別與野生型質(zhì)粒psi-CHECK-PI3K-wild和突變型質(zhì)粒psi-CHECK-PI3K-mutant共轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞，以空載質(zhì)粒做為對照。24 h后，根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒說明書測定熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報(bào)告基因活性。

1.3.6 Western blot檢測:調(diào)整細(xì)胞濃度，按1×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，分組處理同上，置入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱12 h，加入裂解液，常規(guī)方法提取各組細(xì)胞中的FRY和NRP1，BCA測定蛋白含量，取50 μg 蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉，加入相應(yīng)一抗(1∶2 000)，維持4℃過夜孵育，次日PBS漂洗，加入二抗(1∶5 000)，PBS漂洗，ECL顯色。Image Quant軟件掃描并分析相應(yīng)蛋白的灰度值，用GAPDH為內(nèi)參蛋白，來計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織和正常組織中miRNA-217、PI3K、p-AKT和E2F3表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，miRNA-217在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織(P<0.05)；Western blot檢測結(jié)果顯示P13K/AKT信號通路中PI3K、P-AKT及E2F3蛋白在膀胱癌組織表達(dá)明顯高于正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 miR-217、PI3K、p-AKT和E2F3相對表達(dá)量

圖1 miRNA-217、PI3K、p-AKT和E2F3在膀胱癌組織和正常組織表達(dá)

2.2 細(xì)胞系構(gòu)建 qRT-PCR結(jié)果顯示，空白對照組、RSK4-NC組和RSK4-miRNA-217組細(xì)胞中miRNA-217的相對表達(dá)量分別為0.97±0.18、1.02±0.10和1.82±0.15，與空白對照組和RSK4-NC組比較，RSK4-miRNA-217組細(xì)胞中miRNA-217的表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白對照組和RSK4-NC組miRNA-217的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示成功構(gòu)建miRNA-217過表達(dá)細(xì)胞系。

2.3 CCK-8檢測miRNA-217對細(xì)胞增殖能力的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組和RSK4-NC組比較，RSK4-miRNA-217組細(xì)胞OD450明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miRNA-217后，RSK4-miRNA-217組細(xì)胞克隆數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對照組和RSK4-NC組細(xì)胞增殖和細(xì)胞克隆數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表2。

圖2 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

表2 miRNA-217對T24細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 裸鼠皮下成瘤能力 空白對照組、RSK4-NC組和RSK4-miRNA-217組移植瘤體積分別為(20.02±1.53)mm3、(21.12±1.60)mm3和(46.65±3.25)mm3，與空白對照組和RSK4-NC組比較，RSK4-miRNA-217組細(xì)胞移植瘤體積明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對照組和RSK4-NC組細(xì)胞間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.5 miR-217和PI3K關(guān)系預(yù)測及驗(yàn)證 經(jīng)www.

圖3 miRNA-217對裸鼠皮下成瘤能力增殖能力的影響

microRNA.org網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-217和PI3K之間有互補(bǔ)結(jié)合序列，提示兩者具有靶向調(diào)控關(guān)系。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-217能顯著抑制野生型psi-CHECK-PI3K-wild的熒光素梅活性(P<0.05)，而對突變型psi-CHECK-PI3K-mutant的熒光素酶活性無影響(P>0.05)。說明miR-217能特異性結(jié)合PI3K。見圖4，表3。

圖4 www.microRNA.org網(wǎng)站預(yù)測miR-217和PI3K的結(jié)合位點(diǎn)

表3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果

2.6 miRNA-217對T24細(xì)胞PI3K、p-AKT、E2F3表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與空白對照組和RSK4-NC組比較，RSK4-miRNA-217組細(xì)胞PI3K、p-AKT、E2F3蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在空白對照組和RSK4-NC組細(xì)胞中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4，圖5。

表4 PI3K、p-AKT和E2F3在T24細(xì)胞中相對表達(dá)量

3 討論

膀胱癌因其發(fā)病位置比較隱蔽，不容易檢查，且早期癥狀復(fù)雜，缺少明顯的特征，所以往往被忽視，導(dǎo)致診斷和治療延誤，所以確診時(shí)一般多屬癌癥中期或者晚期，已經(jīng)不能進(jìn)行手術(shù)切除或者局部放療，且其預(yù)后較差[6]，給患者的家庭和社會均帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此從分子生物學(xué)角度出發(fā)尋找其進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，對于患者選擇合適的治療方法和預(yù)后指標(biāo)的判定有著重要的意義。

圖5 miRNA-217過表達(dá)后T24細(xì)胞中PI3K、p-AKT和E2F3表達(dá)

目前，microRNAs已被發(fā)現(xiàn)廣泛分布于多個(gè)物種中，1個(gè)microRNA在同一物種的單一細(xì)胞類型中可調(diào)控多個(gè)功能靶標(biāo)，多個(gè)microRNAs則可競爭或協(xié)同靶向調(diào)控1個(gè)mRNA[7]。此外，miRNAs在多種腫瘤中表達(dá)異常，且在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中，通過調(diào)控癌基因或抑癌基因間接參與癌細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程[8]。miRNA-217位于染色體lp36.2上，全長95個(gè)核苷酸，Nakashima等[9]報(bào)道m(xù)iRNA-217誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞通過Wnt/β-catenin途徑增殖并增強(qiáng)轉(zhuǎn)移。但其他研究表明，miRNA-217抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，miRNA-217通過抑制環(huán)氧合酶-2抑制腫瘤的增殖侵襲[10]。miRNA-217通過抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲蛋白1抑制腫瘤增殖侵襲[11]。miRNA-217通過靶向三陰性乳腺癌中的偏二氫吡啶抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[12]，miRNA-217在腫瘤轉(zhuǎn)移中的不同作用，可能取決于腫瘤和組織類型[13]。本研究結(jié)果顯示膀胱癌組織中miRNA-217表達(dá)水平明顯高于正常組織，提示miRNA-217在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。為了進(jìn)一步研究miRNA-217在膀胱癌中的作用，本研究構(gòu)建了miRNA-217過表達(dá)細(xì)胞系，結(jié)果顯示LmiRNA-217上調(diào)后，促進(jìn)了膀胱癌細(xì)胞T24的增殖和侵襲能力。

miRNA-217對不同腫瘤有不同靶標(biāo)，這些不同靶標(biāo)發(fā)揮不同作用。例如，miRNA-217通過靶向Serbp1抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[14]，通過靶向α5整合素促進(jìn)人肝癌細(xì)胞的失活[15]，通過抑制Zeste同源物的增強(qiáng)子抑制人肝細(xì)胞癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]。研究表明，P13/AKT信號通路在各種類型的癌癥中會異常激活，與腫瘤細(xì)胞的生存、增殖和侵襲過程可能息息相關(guān)[17]。幾項(xiàng)研究表明miRNA可以通過靶向P13/AKT信號通路調(diào)控腫瘤發(fā)生。例如，miR-1246通過靶向P13促進(jìn)食管癌轉(zhuǎn)移[18]，miR-1303通過靶向P13促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞增殖[19]。本研究經(jīng)www.microRNA.org網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)miRNA-217和P13K有互補(bǔ)結(jié)合序列，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者的靶向結(jié)合關(guān)系。PI3K也介導(dǎo)miRNA對化療的耐藥性和轉(zhuǎn)移的影響[20]。E2F3是P13/AKT信號通路下游重要蛋白，參與細(xì)胞分化、增殖以及侵襲等生物反應(yīng)過程[21]。E2F3作為一種細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白，在細(xì)胞周期的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，并參與體內(nèi)主要兩條細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)和腫瘤監(jiān)控途徑的表達(dá)[22]。本研究結(jié)果顯示miRNA-217過表達(dá)組PI3K、P-AKT和E2F3表達(dá)均上調(diào)，說明PI3K受 miRNA-217靶向調(diào)控，功能性P-AKT表達(dá)增多，促進(jìn)E2F3蛋白表達(dá)。

綜上所述，miRNA-217促進(jìn)了膀胱癌細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能是miRNA-217通過靶向P13/AKT信號通路調(diào)控E2F3表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。