陳衎　唐金艷　馬曉蓉　韓璐

摘要 目的：探討壽胎丸治療早發(fā)性卵巢功能不全的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)特征。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）、中醫(yī)分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM）、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得壽胎丸活性成分及疾病靶點(diǎn)，利用Venn在線工具篩選二者交集基因，依托STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖和靶點(diǎn)間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖;通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集基因進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)圖來(lái)展示壽胎丸治療早發(fā)性卵巢功能不全的相關(guān)作用機(jī)制。結(jié)果：篩選出壽胎丸活性成分21個(gè)，成分靶點(diǎn)591個(gè)及疾病靶點(diǎn)2 438個(gè)，主要化合物有槲皮素、賴氨酸等。獲得交集基因共67個(gè)，壽胎丸可能通過(guò)過(guò)氧化氫酶（CAT）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等靶點(diǎn)發(fā)揮作用，GO分析結(jié)果顯示，其生物過(guò)程主要是藥物反應(yīng)，細(xì)胞組分主要是血紅素結(jié)合反應(yīng)，分子功能主要集中在線粒體基質(zhì)。主要涉及的相關(guān)信號(hào)通路有缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)通路，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K-AKT）信號(hào)通路。結(jié)論：壽胎丸的多種活性成分可能作用于CAT、EGF等相關(guān)靶點(diǎn)，通過(guò)HIF-1、PI3K/AKT等主要信號(hào)通路，多靶點(diǎn)、多通路的發(fā)揮治療早發(fā)性卵巢功能不全的作用。

關(guān)鍵詞 壽胎丸;早發(fā)性卵巢功能不全;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);活性成分;靶點(diǎn);信號(hào)通路;作用機(jī)制

Abstract Objective：To investigate the network pharmacology of Shou Tai Pills in the treatment of premature ovarian insufficiency.Methods：Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine（BATMAN-TCM） and GeneCards database were used to obtain the active ingredient and disease targets of Shou Tai Pills; Venn online tools were used to screen both intersection genes; relying on the STRING database，Cytoscape 3.7.0 software were used to build active ingredient-targets between network diagram and the target protein-protein interaction（PPI） network diagram; Gene ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analysis were performed on the intersection genes by David database，and a network diagram of active ingredients-target-key pathway was constructed to demonstrate the relevant mechanism of Shou Tai Wan in the treatment of premature ovarian insufficiency.Results：A total of 21 active components，591 components targets and 2 438 disease targets were screened out，the main compounds were quercetin，lysine，etc.A total of 67 overlapping genes were obtained，suggesting that Shou Tai Wan may act through catalase（CAT），epidermal growth factor（EGF） and other targets.GO analysis results showed that the biological process of Shou Tai Wan was mainly drug reaction，the cell component was mainly heme binding reaction，and the molecular function was mainly concentrated in mitochondrial matrix.The major related signaling pathways involved are hypoxia inducible factor 1（HIF-1） signaling pathway and phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B（PI3K-AKT） signaling pathway.Conclusion：A variety of active ingredients of Shou Tai Pills may act on CAT，EGF and other related targets，and play a role in the treatment of premature ovarian insufficiency through HIF-1，PI3K/AKT and other major signaling pathways.

Keywords Shou Tai Pills; Premature ovarian insufficiency; Network pharmacology; Active ingredients; Target; Signal path; Action mechanism

中圖分類號(hào)：R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.003

早發(fā)性卵巢功能不全（Premature Ovarian Insufficiency，POI）是指女性在40歲前出現(xiàn)的一種生殖內(nèi)分泌疾病，具有代謝紊亂和生殖障礙的特征。常伴有月經(jīng)紊亂、生育力下降、煩躁失眠、潮熱汗出及性欲減退等，其發(fā)病與卵巢衰老過(guò)程有關(guān)，根據(jù)歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(huì)（ESHRE）專家共識(shí)所規(guī)范的診斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)月經(jīng)稀發(fā)或停經(jīng)大于4個(gè)月，且伴有至少2次血清基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）>25 IU/L（間隔>4周）或一次性FSH>40 IU/L即可診斷POI。POI的發(fā)病率為1%～5%，發(fā)病原因暫不明確，可能與遺傳、免疫、心理、醫(yī)源性因素和環(huán)境感染等有關(guān)。目前，POI的主要治療方法為激素替代治療（HRT），其他輔助方法有免疫治療、干細(xì)胞治療、促生育治療、基因治療等[1]，雖然在短期治療中有一定的臨床療效和優(yōu)點(diǎn)，但在技術(shù)方法和相關(guān)倫理道德的標(biāo)準(zhǔn)上具有一定的局限所在。

中醫(yī)學(xué)無(wú)此病名，但根據(jù)早發(fā)性卵巢功能不全的主要特征，可以將其歸于“月經(jīng)過(guò)少”“閉經(jīng)”“不孕”“經(jīng)斷前后諸癥”等病的范疇?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》載：“女子七歲，腎氣盛……七七，任脈虛，太沖脈衰，天癸竭，地道不通，故形壞而無(wú)子也。”《傅青主女科》曰：“經(jīng)水出諸腎。”中醫(yī)認(rèn)為，腎為先天之本，主司人體生長(zhǎng)發(fā)育與生殖，調(diào)控著女子月經(jīng)來(lái)潮及養(yǎng)精種子，是故腎氣充盛，則天癸盛，腎氣衰少，則天癸竭。故歷代醫(yī)家認(rèn)為早發(fā)性卵巢功能不全的發(fā)生總歸于腎虛，導(dǎo)致腎-天癸-沖任-胞宮軸功能失衡，兼以脾虛、氣血兩虛、肝郁、血瘀、痰濁等，從而致病。故臨床多以補(bǔ)腎為基本法，以治腎為要，輔以疏肝健脾、活血化瘀等，從扶正補(bǔ)虛這一角度治療POI。

壽胎丸是治療胎漏、胎動(dòng)不安的經(jīng)典方劑，由菟絲子、續(xù)斷、桑寄生、阿膠組成，源于清代名醫(yī)張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，具有補(bǔ)腎、固沖、安胎之效。方中菟絲子為補(bǔ)腎安胎之要藥，故重用為君;臣以續(xù)斷、桑寄生補(bǔ)益肝腎，調(diào)理沖任;佐使血肉有情之品阿膠以滋養(yǎng)陰血，使沖任血旺，共奏補(bǔ)腎固沖安胎之效。臨床常使用壽胎丸治療相關(guān)婦科疾病，并具有一定療效[2]，但其作用機(jī)制尚不明確，缺乏現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)，此外中藥及其復(fù)方成分的復(fù)雜性也是制約系統(tǒng)研究其具體活性成分及相關(guān)信號(hào)通路、靶點(diǎn)的關(guān)鍵因素。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)挖掘及分析的一種方法，基于現(xiàn)代生物信息技術(shù)，通過(guò)對(duì)藥物、活性成分、作用靶點(diǎn)、疾病間的相互關(guān)系，發(fā)掘及闡述中藥治療相關(guān)疾病的潛在作用機(jī)制，在中醫(yī)證候、方劑配伍規(guī)律及不良反應(yīng)等方面的研究中發(fā)揮積極作用，其能從客觀角度幫助我們進(jìn)行中醫(yī)藥的研究[3]。故本研究將通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討壽胎丸治療POI的作用機(jī)制，為其提供基礎(chǔ)生物學(xué)信息依據(jù)，對(duì)臨床治療POI提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 壽胎丸活性成分及靶點(diǎn)蛋白的篩選 利用TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），搜索菟絲子、續(xù)斷、桑寄生的主要化學(xué)成分，對(duì)比藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)（ADME），將其標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，初步挑選壽胎丸的潛在藥物活性化合物，依托BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）檢索與阿膠相關(guān)的有效化學(xué)成分，以相關(guān)閾值Score cutoff≥20，P值≤0.001作為限定條件初步篩選阿膠活性化合物。選取具有明確作用靶點(diǎn)的活性成分作為壽胎丸候選活性化合物，同時(shí)，提取它們的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）規(guī)范靶點(diǎn)蛋白名稱。

1.2 POI相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）中檢索與早發(fā)性卵巢功能不全疾病相關(guān)的靶點(diǎn)基因，并記錄靶點(diǎn)基因的Score值，將Score值大于中位值的目標(biāo)靶點(diǎn)作為早發(fā)性卵巢功能不全的候選靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建壽胎丸主要活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 為明確壽胎丸活性成分靶點(diǎn)與早發(fā)性卵巢功能不全疾病靶點(diǎn)間的關(guān)系，將已獲得的壽胎丸活性成分靶點(diǎn)與POI疾病靶點(diǎn)，利用Venn在線工具（http：//bioinformatics.psb.u-gent.be/webtools/Venn/）繪制韋恩圖，獲得交集基因。將其通過(guò)Cytoscape 3.7.0軟件可視化展示壽胎丸主要活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 構(gòu)建壽胎丸與POI交集基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 將交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org），將生物種類設(shè)定為“Homo Sapiens”，最小相互作用閾值設(shè)定為“medium confidence>0.4”，同時(shí)隱藏游離點(diǎn)，其余設(shè)置均為默認(rèn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并通過(guò)Cytoscape3.7.0軟件進(jìn)行可視化展示。

1.5 交集基因的富集分析 為闡明壽胎丸治療早發(fā)性卵巢功能不全靶點(diǎn)在信號(hào)通路中的作用，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），對(duì)所提取的交集基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，設(shè)定P<0.001，P值越小，則富集結(jié)果顯著性越高，將GO及KEGG分析結(jié)果的P值由小到大排序，并將分析結(jié)果通過(guò)微生信在線作圖平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行可視化展示。

1.6 構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)圖 將KEGG通路富集分析中前15條關(guān)鍵通路與壽胎丸的活性成分、作用靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，通過(guò)Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖，直觀地展現(xiàn)壽胎丸治療早發(fā)性卵巢功能不全的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，闡述壽胎丸對(duì)治療早發(fā)性卵巢功能不全的潛在作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 壽胎丸有效活性成分及作用靶點(diǎn)蛋白的篩選結(jié)果 通過(guò)TCMSP及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得菟絲子活性成分11個(gè)，桑寄生活性成分2個(gè)，續(xù)斷活性成分8個(gè)，阿膠活性成分3個(gè)，合并去重后獲得壽胎丸活性成分21個(gè)。見表1。并通過(guò)TCMSP查詢這21個(gè)活性成分作用的靶點(diǎn)信息，合并去重后得到壽胎丸的靶點(diǎn)數(shù)目為591個(gè)，將其通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)行規(guī)范化命名，最終得到壽胎丸的相關(guān)基因靶點(diǎn)。

2.2 POI靶點(diǎn)的收集結(jié)果 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲取“POI”及“Primary Ovarian Insufficiency”的相關(guān)靶點(diǎn)基因，共得到POI靶點(diǎn)基因5 092個(gè)，Primary Ovarian Insufficiency靶點(diǎn)基因227個(gè)，將靶點(diǎn)基因Score值從小到大排列，取其中位數(shù)4.57，將其大于4.57的靶點(diǎn)基因選取，合并去重后得到POI相關(guān)靶點(diǎn)基因2 438個(gè)。

2.3 壽胎丸主要活性成分-疾病靶點(diǎn)圖的構(gòu)建結(jié)果利用Venn在線工具繪制韋恩圖，可以得到其交集基因67個(gè)，將其交集基因?qū)Ρ葔厶ネ杌钚猿煞肿饔冒悬c(diǎn)，可以得到壽胎丸的有效活性成分?jǐn)?shù)目為6個(gè)。見圖1。通過(guò)Cytoscape3.7.0軟件，導(dǎo)入壽胎丸、活性成分、交集基因、POI的相關(guān)信息，制作活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。以節(jié)點(diǎn)表示藥物、活性成分、疾病和交集基因，節(jié)點(diǎn)之間的以邊相連;活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)包含節(jié)點(diǎn)75個(gè)，其中藥物節(jié)點(diǎn)1個(gè)，疾病節(jié)點(diǎn)1個(gè)，活性成分節(jié)點(diǎn)6個(gè)，靶點(diǎn)基因節(jié)點(diǎn)67個(gè)，壽胎丸有效活性成分與靶點(diǎn)基因的邊106條，活性物質(zhì)節(jié)點(diǎn)連接度平均值為17.7，節(jié)點(diǎn)度值越大，表示該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要。故選取節(jié)點(diǎn)連接度大于平均值的活性成分作為候選，其中最高的是槲皮素（Quercetin，節(jié)點(diǎn)連接度為56），其次是賴氨酸（Lysine，節(jié)點(diǎn)連接度為36）。這表明它們?cè)诨钚猿煞?疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖占有核心地位，故此可預(yù)測(cè)槲皮素和賴氨酸是壽胎丸治療POI的主要活性成分。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析結(jié)果 壽胎丸活性成分與早發(fā)性卵巢功能不全交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。該網(wǎng)絡(luò)圖含節(jié)點(diǎn)67個(gè)，節(jié)點(diǎn)度值越高，顏色越深。經(jīng)軟件分析可得平均節(jié)點(diǎn)度值為7.82，選取節(jié)點(diǎn)度值最多的前20個(gè)靶點(diǎn)基因作為其核心基因。見圖4。壽胎丸可能通過(guò)過(guò)氧化氫酶（CAT）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS3）、激活蛋白1（JUN）等關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮治療POI的作用。

2.5 交集基因的富集分析

2.5.1 GO功能富集 將交集基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析，共得到相關(guān)條目258個(gè)，其中生物過(guò)程（BP）199個(gè)，細(xì)胞組分（CC）22個(gè)，分子功能（MF）37個(gè)，主要涉及藥物反應(yīng)、血紅素結(jié)合反應(yīng)等，其主要集中在線粒體基質(zhì)。見表2、圖5。

2.5.2 KEGG通路富集分析 將壽胎丸和早發(fā)性卵巢功能不全的交集基因通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析，導(dǎo)出分析結(jié)果，共得到63條KEGG信號(hào)通路，將其中P值最小的前15條信號(hào)通路作為壽胎丸治療POI的主要信號(hào)通路。見表3。并通過(guò)微生信在線作圖平臺(tái)進(jìn)行可視化展示。見圖6。圖中P值代表該信號(hào)通路的富集程度，P值越小，則富集程度越大，顏色越紅，反之P值越大則富集程度越小，顏色越綠。氣泡的大小代表所富集的基因個(gè)數(shù)。參與壽胎丸治療作用的信號(hào)通路主要有HIF-1信號(hào)通路、精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease）信號(hào)通路、非受體酪氨酸激酶家族（JAK-STAT）信號(hào)通路等。由此可見，壽胎丸是通過(guò)多靶點(diǎn)，多通路來(lái)干預(yù)POI從而達(dá)到治療目的。

2.6 活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建結(jié)果 將前面得到的壽胎丸活性成分、潛在作用靶點(diǎn)及KEGG篩選出來(lái)的前15條信號(hào)通路一一對(duì)應(yīng)，經(jīng)Cytoscape3.7.0軟件制作活性成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路圖。見圖7。壽胎丸治療POI涉及多個(gè)活性成分、靶點(diǎn)及信號(hào)通路。主要活性成分包含槲皮素、賴氨酸等，主要靶點(diǎn)為CAT、JUN、EGF、NOS3等，涉及的主要信號(hào)通路有HIF-1、PI3K-AKT、炎癥性腸病、精氨酸生物合成、JAK-STAT信號(hào)通路等。見圖7。

3 討論

近年來(lái)早發(fā)性卵巢功能不全的發(fā)病率逐漸上升，增加了如骨質(zhì)疏松、糖尿病、高血壓及心腦血管等疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響了育齡期婦女的身心健康及生命質(zhì)量。ESHRE將“原發(fā)性”改為“早發(fā)性”[1]，為的是及時(shí)對(duì)POI作出早期診斷及早期治療?，F(xiàn)國(guó)內(nèi)外治療POI的主要方法為HRT，通過(guò)補(bǔ)充體內(nèi)所缺乏的性激素，調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸的功能起到一定作用，但停藥后常易反復(fù)，并增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、中風(fēng)等相關(guān)疾病的發(fā)病危險(xiǎn)，在POI的長(zhǎng)期治療及管理中存在一定缺陷，且具有一定的禁忌證[4]。其他輔助治療方法雖具有一定優(yōu)勢(shì)，但其治療方法較為復(fù)雜，所需費(fèi)用也較多，且存在一定的倫理問(wèn)題，臨床上對(duì)此類方法的應(yīng)用較為有限。中藥對(duì)調(diào)節(jié)女性內(nèi)分泌功能頗有療效，有研究發(fā)現(xiàn)中藥可以通過(guò)其擬雌激素作用及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能促進(jìn)卵巢功能的恢復(fù)[5]，維持腎-天癸-沖任-胞宮軸功能的平衡，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)HRT治療早發(fā)性卵巢功能不全有著一定的趨同性，且較之不良反應(yīng)低，花費(fèi)少，故在臨床上更易被患者所接受。對(duì)于治療POI的長(zhǎng)期管理更具優(yōu)勢(shì)。壽胎丸是治療婦科疾病的常用基礎(chǔ)方之一，具有補(bǔ)腎固沖助孕安胎之功，現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，菟絲子的主要藥理學(xué)作用包括抗氧化、抗衰老、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、改善生殖功能等[6]，桑寄生的主要藥理作用有抗氧化、降血糖、降血脂等[7]，續(xù)斷的主要藥理學(xué)作用包括抗衰老、保護(hù)神經(jīng)等[8]，阿膠的主要藥理作用有抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗疲勞等作用[9]。由于生育力降低貫穿POI的全過(guò)程，故對(duì)四者合方的壽胎丸治療POI的研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)壽胎丸在臨床上治療流產(chǎn)、不孕、月經(jīng)病等婦科相關(guān)疾病療效較好[2]，但其相關(guān)配伍和藥理學(xué)研究較少，因此本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)技術(shù)及方法，基于現(xiàn)代生物信息數(shù)據(jù)，對(duì)壽胎丸治療早發(fā)性卵巢功能不全的潛在作用機(jī)制進(jìn)行一定的深入研究。

3.1 壽胎丸活性成分與相關(guān)靶點(diǎn)的分析 本研究共篩選出壽胎丸潛在活性成分21種，其中部分化合物已通過(guò)研究證實(shí)具有調(diào)節(jié)卵巢功能、延緩其衰老的作用。壽胎丸的核心化學(xué)物質(zhì)槲皮素具有抗氧化、抗炎等藥理作用[10]，黃長(zhǎng)盛等[11]發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有擬雌激素活性，對(duì)卵巢功能衰退的小鼠有一定的治療效果，同時(shí)也可以改善卵泡質(zhì)量，促進(jìn)各級(jí)卵泡的發(fā)育及卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，增加體內(nèi)雌二醇（E2）的分泌，升高AMH數(shù)值，減少FSH、黃體生成素（LH）的含量，進(jìn)而恢復(fù)卵巢功能。雌激素缺乏會(huì)導(dǎo)致鈣的流失，故POI患者都或多或少伴隨著骨密度的降低。閔珺[12]發(fā)現(xiàn)槲皮素可以有效改善去卵巢小鼠的骨代謝，通過(guò)抑制破骨細(xì)胞對(duì)骨基質(zhì)的吸收，增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化活性，從而提高骨密度，從根本上改善因雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松的癥狀。有研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件下可以通過(guò)補(bǔ)充槲皮素來(lái)減少卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，增高CAT等抗氧化物質(zhì)的含量，提高機(jī)體抗氧化能力，減輕卵巢組織氧化損傷，進(jìn)而維持原始卵泡正常形態(tài)，保護(hù)卵巢功能[13]。壽胎丸的另一個(gè)核心化合物質(zhì)——賴氨酸，是維持正常生命功能的人體必需氨基酸之一，具有增強(qiáng)免疫、促進(jìn)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)等功能。阿孜古麗·要力瓦斯[14]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)賴氨酸可以通過(guò)增強(qiáng)卵巢早衰小鼠的免疫力來(lái)改善卵巢功能，緩解卵巢功能衰退的進(jìn)程。Yang等[15]發(fā)現(xiàn)賴氨酸可以促進(jìn)卵泡的發(fā)育，提高E2含量，增強(qiáng)卵泡支持卵母細(xì)胞成熟的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素及賴氨酸在其網(wǎng)絡(luò)圖中具有重要地位，這表明這2種化合物在壽胎丸維持卵巢功能，延緩其衰老的治療過(guò)程中起著主要作用，其他化合物如精氨酸（Arginine）、芝麻素（Sesamin）等起到輔助作用。這幾種物質(zhì)可能是壽胎丸治療POI的主要有效成分，但目前對(duì)于這幾種活性成分的研究較少，缺少對(duì)其具體的相關(guān)作用機(jī)制、作用途徑的研究，故有待我們進(jìn)一步的研究探討。本研究發(fā)現(xiàn)，壽胎丸可能通過(guò)CAT、EGF、JUN、NOS3等關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用，早發(fā)性卵巢功能不全的發(fā)生有多靶點(diǎn)、多生物過(guò)程及多信號(hào)通路的參與。目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CAT是細(xì)胞叉形頭轉(zhuǎn)錄因子1（FoxO1）信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)，參與細(xì)胞的氧化應(yīng)激（OS）、細(xì)胞凋亡過(guò)程，當(dāng)卵巢發(fā)生再灌注損傷導(dǎo)致OS發(fā)生時(shí)，CAT含量的增加會(huì)增強(qiáng)卵巢抗氧化能力，減輕OS對(duì)卵巢的破壞，抑制細(xì)胞凋亡，并提高成骨細(xì)胞的增殖，延緩骨質(zhì)疏松，當(dāng)CAT含量異常時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致卵泡的凋亡，造成卵巢功能衰竭，并導(dǎo)致骨密度的下降[16-18]。EGF是一種小分子多肽，其正常表達(dá)可以激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）、PI3K等下游信號(hào)通路，并協(xié)同F(xiàn)SH，有效降低卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，減輕卵巢顆粒細(xì)胞的損傷，并增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，為卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、成熟及發(fā)育提供一個(gè)適當(dāng)?shù)沫h(huán)境，有保護(hù)卵巢顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞的作用[19-21]，從而促進(jìn)E2的分泌，維持卵巢功能[22]。目前研究發(fā)現(xiàn)JUN在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，但相關(guān)研究較少，其作用機(jī)制尚未明確[23]。由于POI的發(fā)病可能與自身免疫類疾病有關(guān)，如甲減患者中抗甲狀腺抗體會(huì)引起卵巢功能受損[24]，原發(fā)性慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退癥患者抗腎上腺皮質(zhì)抗體陽(yáng)性會(huì)導(dǎo)致卵巢功能的衰退[25]，故猜測(cè)JUN可能是通過(guò)促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)自身相關(guān)免疫系統(tǒng)疾病的相關(guān)過(guò)程，起到間接治療POI的作用。Taguchi等[26]發(fā)現(xiàn)NOS3的正常表達(dá)可以在一定程度上改善子宮內(nèi)膜容受性，提高子宮內(nèi)膜局部組織的血供，利于胚胎著床，增加妊娠概率，從而改善早發(fā)性卵巢功能不全患者的生育功能。由此可見，壽胎丸可能通過(guò)以上核心靶點(diǎn)，通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力、減輕細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)生育等方面來(lái)發(fā)揮治療POI的作用。

3.2 壽胎丸GO功能富集分析 壽胎丸治療POI涉及多種生物過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能。生物過(guò)程主要涉及藥物反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、過(guò)氧化氫生物合成、過(guò)氧化氫反應(yīng)等。其中，過(guò)氧化氫反應(yīng)與POI的發(fā)生有著密切關(guān)系。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH具有調(diào)節(jié)竇卵泡抗氧化應(yīng)激的能力，其含量與總氧化劑狀態(tài)、OS指數(shù)正相關(guān)，當(dāng)FSH上調(diào)的抗氧化防御機(jī)制失衡而撤退，或暴露于活性氧（ROS）時(shí)，ROS會(huì)進(jìn)一步通過(guò)OS過(guò)程激活下游信息分子，引起卵泡閉鎖，降低卵泡質(zhì)量及數(shù)量，同時(shí)，體內(nèi)過(guò)多的過(guò)氧化氫會(huì)嚴(yán)重抑制LH的敏感性及類固醇的產(chǎn)生，通過(guò)影響體內(nèi)類固醇代謝導(dǎo)致機(jī)體甾體合成途徑受阻，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞分泌E2減少，從上游進(jìn)一步導(dǎo)致卵巢功能的破壞[27-30]。當(dāng)機(jī)體處于OS狀態(tài)時(shí)，通過(guò)添加抗氧化物質(zhì)可以顯著提高CAT、超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低卵巢ROS水平，從而保護(hù)卵巢的正常功能，減少POI的發(fā)生[31-32]。細(xì)胞組分主要與血紅素結(jié)合反應(yīng)相關(guān)，該反應(yīng)通過(guò)血紅素結(jié)合蛋白（Hpx）的表達(dá)來(lái)起到抗氧化、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、調(diào)控信號(hào)通路的作用[33]。由于卵巢中含有豐富的血供，Hpx在血液中可以誘導(dǎo)相關(guān)酶的基因表達(dá)，鈍化ROS，并通過(guò)其降解產(chǎn)物如膽綠素等來(lái)調(diào)節(jié)OS[34]，另一方面，在血紅素促脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)過(guò)程，Hpx復(fù)合物可以阻斷其反應(yīng)發(fā)生，從而有效減少血紅素帶來(lái)的細(xì)胞氧化損傷[35]。鄧玉潔等[36]發(fā)現(xiàn)多芳香烴暴露對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞基因表達(dá)、生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有影響，可損傷卵母細(xì)胞并使生長(zhǎng)卵泡發(fā)生閉鎖，導(dǎo)致組織發(fā)生損傷效應(yīng)，而Hpx的表達(dá)會(huì)隨多環(huán)芳烴暴露程度的加重而增加，故可以檢測(cè)Hpx指標(biāo)來(lái)作為機(jī)體化學(xué)暴露的指標(biāo)之一，對(duì)預(yù)測(cè)POI的發(fā)生提供了相關(guān)指標(biāo)[37]。分子功能的發(fā)生主要集中在線粒體基質(zhì)，線粒體功能的異常常伴隨著人類疾病及衰老的發(fā)生，同時(shí)也是細(xì)胞氧化應(yīng)激發(fā)生的主要場(chǎng)所。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能異常與卵巢衰老密切相關(guān)，當(dāng)卵巢衰老過(guò)程發(fā)生時(shí)，常伴隨著卵母細(xì)胞線粒體功能及結(jié)構(gòu)的異常[38]。王博[39]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)線粒體受外來(lái)化學(xué)物質(zhì)干擾時(shí)，其膜電勢(shì)會(huì)降低，同時(shí)抑制線粒體復(fù)合物I的活性，誘導(dǎo)線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激，破壞卵巢功能，而補(bǔ)腎中藥可以有效改善POI小鼠卵母細(xì)胞線粒體形態(tài)、數(shù)量、分布及其活力水平，調(diào)節(jié)激素水平和氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而恢復(fù)卵巢功能[40]，所以可以通過(guò)改善線粒體功能，增加線粒體數(shù)量來(lái)維持卵母細(xì)胞的正常功能，延緩POI的發(fā)生。以上均表明，壽胎丸治療POI可能涉及多種生物過(guò)程、細(xì)胞組分及相應(yīng)分子功能。

3.3 關(guān)鍵信號(hào)通路的相關(guān)機(jī)制分析 HIF-1信號(hào)通路是POI的核心通路之一。HIF-1是組織細(xì)胞缺氧狀態(tài)下廣泛存在的一種轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體氧化應(yīng)激過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。HIF-1信號(hào)通路可以由HIF-1的異常表達(dá)而被激活，從而誘導(dǎo)卵巢中HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)的增加，并特異性表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞，且與雌激素受體的表達(dá)正相關(guān)，而雌激素受體主要存在于卵囊泡膜細(xì)胞，這表明HIF-1信號(hào)通路可能直接作用于卵巢[41-42]。相關(guān)研究表明，溫經(jīng)湯可以參與OS過(guò)程，糾正局部組織缺氧狀態(tài)，調(diào)控HIF-1信號(hào)通路的表達(dá)，防止卵巢早衰[43]。PI3K-AKT信號(hào)通路是廣泛表達(dá)于機(jī)體各處的基礎(chǔ)信號(hào)通路之一，同時(shí)也是細(xì)胞增殖、凋亡最主要的傳導(dǎo)通路之一。有研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞中存在大量的PI3K和AKT，PI3K-AKT信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、原始卵泡發(fā)育以及顆粒細(xì)胞的增殖、分化[44]。當(dāng)其正常表達(dá)時(shí)，可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，維持卵巢的正常功能，同時(shí)也能與分布在卵巢顆粒細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，增加雌孕激素的分泌，延緩其衰老。當(dāng)PI3K受到缺氧、細(xì)胞因子等細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí)可被過(guò)度激活，進(jìn)而誘導(dǎo)AKT，通過(guò)調(diào)控其下游哺乳動(dòng)物雷帕霉素（mTOR）來(lái)誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的閉鎖，而如果PI3K的信號(hào)終止，也可引起原始卵泡的提前發(fā)育，使其過(guò)快凋亡，從而導(dǎo)致POI的發(fā)生[45-46]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)方法，將現(xiàn)代生物學(xué)信息技術(shù)與傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論相結(jié)合，對(duì)壽胎丸組成藥物的化合物、有效活性成分、靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)及信號(hào)通路進(jìn)行分析，運(yùn)用相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及信息軟件構(gòu)建活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，直觀體現(xiàn)了壽胎丸治療POI是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)的方式發(fā)揮其功效，同時(shí)PPI網(wǎng)絡(luò)圖也反映了該藥治療POI相關(guān)各靶點(diǎn)間的聯(lián)系程度，并結(jié)合GO富集分析與KEGG信號(hào)通路分析，初步探討了壽胎丸治療POI復(fù)雜的作用機(jī)制[47]。本研究發(fā)現(xiàn)，POI的發(fā)病涉及多種反應(yīng)機(jī)制，如氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)等，壽胎丸對(duì)POI的作用主要通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力，抑制細(xì)胞凋亡等發(fā)揮治療作用，并激發(fā)與卵巢發(fā)育有關(guān)的mRNA及相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)揮擬雌激素樣作用，刺激原始卵泡和卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，從而延緩卵巢衰老，維持其正常生理功能。雖然通過(guò)活性成分-疾病靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖可以清楚表明壽胎丸復(fù)雜的作用機(jī)制，但缺乏相關(guān)研究，對(duì)于各靶點(diǎn)、信號(hào)通路之間關(guān)系的闡述不夠充分，且由于中藥復(fù)方之間化學(xué)成分的復(fù)雜作用機(jī)制尚不明確，故本研究具有一定的局限性。同時(shí)，除現(xiàn)有已經(jīng)明確的對(duì)POI有治療效果的活性成分及信號(hào)通路外，本研究還發(fā)現(xiàn)了其他潛在成分（精氨酸、芝麻素等）、靶點(diǎn)（EGF、JUN等）及信號(hào)通路（Jak-STAT、IBD等），為POI后續(xù)研究、臨床藥物的使用及相關(guān)治療藥物的研發(fā)提供了一定參考。

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（2021-01-20收稿 責(zé)任編輯：魏慶雙）