胡南，陳雪，張輝，李艾書，李廣悅，王永東，丁德馨

（南華大學鈾礦冶生物技術(shù)國防重點學科實驗室，湖南衡陽 421001）

引 言

鈾礦采冶會產(chǎn)生大量的低濃度鈾廢水[1]。廢水中的鈾可在動植物體內(nèi)積累，進而通過食物鏈進入人體，對人類健康造成極大危害[2-3]。因此，修復(fù)低濃度鈾廢水對于環(huán)境安全和人體健康都至關(guān)重要。

低濃度鈾廢水的修復(fù)技術(shù)主要包括物理修復(fù)、化學修復(fù)和生物修復(fù)。微生物修復(fù)具有成本低、操作簡單、對環(huán)境干擾性小等優(yōu)點，為低濃度鈾廢水修復(fù)提供了更綠色、經(jīng)濟和穩(wěn)定的手段[4]。微生物固定金屬是通過氧化還原反應(yīng)、形成難溶復(fù)合物或沉淀等方式改變金屬的化學狀態(tài)以減少它們的流動性和環(huán)境毒性[5-6]。研究表明，微生物能夠與重金屬以生物吸附、生物礦化、生物還原和生物積累的方式相互作用，從而達到修復(fù)重金屬污染的目的[7]。微生物誘導碳酸鹽沉淀(MICP)是一種高效、經(jīng)濟的生物地球化學方法，近些年廣泛應(yīng)用于修復(fù)環(huán)境中的重金屬污染。一類具有產(chǎn)脲酶特性的碳酸鹽礦化菌引起了科研人員的關(guān)注，其主要作用是提供脲酶和晶核[8]。碳酸鹽礦化菌分泌的脲酶能夠分解尿素，產(chǎn)生CO2-3和NH+4；利用其生長過程中產(chǎn)生的大量胞外聚合物(EPS)作為某些礦化產(chǎn)物成核的附著面[8]。在有足夠Ca2+存在的條件下，發(fā)生碳酸鹽沉淀[9-12]。碳酸鹽在沉淀過程中，可以捕獲部分重金屬或放射性元素，這些元素一般以類質(zhì)同象置換的方式占據(jù)碳酸鈣中的Ca2+或CO2-3位置[8]。已有研究表明，產(chǎn)脲酶菌可誘導碳酸鹽沉淀對鉻、鎘、銅、鎳和鍶等重金屬進行固定[13-17]。但目前為止還沒有利用微生物誘導碳酸鹽-鈾共沉淀修復(fù)低濃度鈾廢水方面的研究。

本文通過向低濃度鈾廢水中添加碳酸鹽礦化菌Sporosarcina pasteurii(ATCC 11859)、氯化鈣和尿素，研究S.pasteurii誘導碳酸鈣-鈾共沉淀對低濃度鈾廢水中鈾的去除效果及其影響因素。本研究的目的是提出一種采用S.pasteurii誘導碳酸鹽-鈾共沉淀修復(fù)低濃度鈾廢水的方法。

1 試驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗試劑 產(chǎn)脲酶的陽性巴氏芽孢桿菌S.pasteurii（BNCC 337394，是ATCC 11859的傳代菌），乙酸雙氧鈾，無水氯化鈣，硝酸，鹽酸，氫氧化鈉等。

試驗用培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH至7.0，隨后放入高壓滅菌鍋121℃滅菌30 min。滅菌完畢冷卻后，在超凈工作臺內(nèi)向其中加入2%經(jīng)無菌濾頭過濾除菌后的尿素。

改良培養(yǎng)液：牛肉膏0.06%，蛋白胨0.1%，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，滅菌完畢冷卻后加入2%經(jīng)無菌濾頭過濾除菌后的尿素。

1.1.2 分析測試儀器PHSJ-3G型pH計，博訊SW-CJ-1FD型單人單面潔凈工作臺，GI-54DWS型高壓滅菌鍋，ZQZY-78AV全溫振蕩培養(yǎng)箱，D-7型紫外可見分光光度計，Eppendrof AG 22331 Hamburg生物分光光度計，AL104型電子天平，PinAAcle 900E火焰原子吸收分光光度計，TGL18M高速冷凍離心機。沉淀的元素組成用掃描電鏡-能譜儀分析(Zeiss,蔡司Sigma300,GER)；沉淀的礦物類型用X射線全自動衍射儀分析(Rigaku,UltimaⅣ,JPN)。鈾濃度采用5-Br-PADAP分光光度法測量[18]。

1.2 方法

1.2.1 微生物的生長過程監(jiān)測 取新鮮活化的OD600值為1.0的菌液接種到初始pH為4.5的液體培養(yǎng)基中，接種量為1%（體積分數(shù)），置于180 r/min搖床中恒溫30℃培養(yǎng)。利用生物分光光度計、pH酸度計監(jiān)測細菌的生物量和溶液的pH，以反映細菌的生長過程。利用顯色劑（對二甲氨基苯甲醛）與尿素反應(yīng)，在紫外可見分光光度計430 nm處進行比色測定尿素的殘留量[19]，間接反映細菌產(chǎn)脲酶的能力。

1.2.2S.pasteurii對鈾的耐受性 配制pH為4.5的液體培養(yǎng)基，滅菌后向錐形瓶中加入一定體積的5 g/L過濾滅菌的乙酸雙氧鈾母液使鈾濃度分別為10、50、100、300和500 mg/L，以不添加鈾的處理為對照組，向每個錐形瓶中接種1%OD600值為1.0的菌液，置于恒溫30℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)。每組試驗設(shè)3個平行樣，分別在培養(yǎng)24 h和72 h后取樣測OD600值。

1.2.3 鈾的非生物沉淀 為了避免在試驗過程中鈾與微生物以外的因素發(fā)生化學相互作用而影響微生物修復(fù)低濃度鈾廢水的效果。將改良培養(yǎng)液的pH調(diào)到4.5，設(shè)置鈾濃度為60 mg/L。試驗處理分為4組，試驗條件分別為：A組只在培養(yǎng)液中添加鈾；B組在培養(yǎng)液中添加鈾和1%OD600值為1.0的菌液；C組在培養(yǎng)液中添加鈾和1 g/L的Ca2+；D組在培養(yǎng)液中添加鈾、1 g/L的Ca2+和1%OD600值為1.0的菌液。置于180 r/min搖床中恒溫30℃培養(yǎng)，每組試驗設(shè)3個平行樣。

1.2.4 Ca2+濃度對固定鈾的影響 為了探究Ca2+濃度對微生物誘導碳酸鹽-鈾共沉淀固定鈾效果的影響，配制改良培養(yǎng)液并調(diào)節(jié)pH為4.5、鈾濃度為60 mg/L。設(shè)置不添加Ca2+的對照組，Ca2+濃度分別為1、2、3、5和10 g/L的試驗組，并向每個錐形瓶中接種1%OD600值為1.0的菌液。置于恒溫30℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)，3 d后取樣測鈾濃度。同時考察不同Ca2+濃度條件下，鈾和Ca2+濃度隨時間的變化，并監(jiān)測反應(yīng)過程中pH的變化。

1.2.5 初始pH及溫度對固定鈾的影響 向250 ml錐形瓶中加入100 ml培養(yǎng)液，設(shè)置鈾濃度為50 mg/L、Ca2+濃度為10 g/L，使初始pH分別為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5和8.5，培養(yǎng)溫度分別為10、20、30和40℃，向錐形瓶中接種1% OD600值為1.0的菌液，置于180 r/min搖床中培養(yǎng)。間隔一定時間取樣測鈾濃度，考察不同初始pH和培養(yǎng)溫度對鈾的固定的影響。

1.2.6S.pasteurii誘導碳酸鹽沉淀對鈾的固定機理對Ca2+濃度為1 g/L的試驗組產(chǎn)生的沉淀用超純水洗滌2次，在高速離心機中以6000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后回收，在60℃的干燥箱中干燥48 h，然后充分研磨，再用掃描電鏡-能譜儀(SEM-EDS)和X射線衍射儀(XRD)進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用WPS軟件整理試驗數(shù)據(jù)，計算平均值及標準差；用Origin 2019繪圖；用Jade 6.0匹配XRD譜圖；用SPSS 26.0進行方差分析，通過LSD多重比較法檢驗處理間的差異顯著性(P<0.05)，用不同英文字母表示差異顯著性（同時結(jié)合顯著性水平以及均值，用a~d和A~D表示）。

2 結(jié)果與討論

2.1 S.pasteurii生長過程

圖1所示為S.pasteurii生長過程中培養(yǎng)基內(nèi)的細菌數(shù)量、尿素含量和pH隨時間的變化。從圖1(a)可看出，開始3 h細菌的數(shù)量較低，隨著細菌的大量繁殖，菌液變渾濁，9 h后細菌數(shù)量趨于穩(wěn)定。S.pasteurii生長前期培養(yǎng)基中尿素的含量急劇下降，說明該菌具有高產(chǎn)脲酶的特性，能在短時間產(chǎn)生大量脲酶分解尿素。圖1(b)為菌株生長過程中菌液的pH變化，pH短期內(nèi)從初始的4.5升至9.5并趨于穩(wěn)定。試驗過程中，菌株在培養(yǎng)基中生長代謝分泌脲酶，從而分解尿素并產(chǎn)生CO2-3與NH+4，導致溶液的pH升高[20]，更利于菌體的生長繁殖。此外，pH上升有利于碳酸鹽礦化產(chǎn)物的穩(wěn)定[21]，在修復(fù)低濃度鈾廢水的實際應(yīng)用方面，避免了低pH條件下鈾的再釋放。

圖1 S.pasteurii生長過程監(jiān)測Fig.1 Monitoring the growth process of S.pasteurii

2.2 S.pasteurii對鈾的耐受性

細菌對高鹽度、高溫和強輻射的惡劣環(huán)境，如放射性廢物處理場等具有很強的適應(yīng)性[22-24]。但是生物體對重金屬濃度具有一定的耐受范圍，鈾作為一種放射性重金屬元素且具有生物毒性，可能會對微生物的生長產(chǎn)生影響。如圖2所示，24 h內(nèi)低于50 mg/L的鈾濃度對細菌生長產(chǎn)生一定程度的促進作用，但隨著濃度升高這種作用逐漸減弱，高濃度的鈾開始抑制細菌生長。第72 h，細菌在300和500 mg/L鈾濃度條件下快速生長，推測原因是微生物適應(yīng)了高濃度鈾的生物毒性作用并產(chǎn)生抗性，在其脅迫下自身新陳代謝活動產(chǎn)生了相應(yīng)的變化，從而適應(yīng)了受鈾污染的環(huán)境[25]。Mugwar等[26]的研究表明，當微生物所處環(huán)境的金屬離子濃度高過其生長的最低抑制濃度時，細菌的活性較低，同時也會導致尿素水解速率降低，也有研究證明一定濃度的金屬離子會刺激細菌的生長[27]。

圖2 S.pasteurii對鈾的耐受性Fig.2 Tolerance of S.pasteurii to uranium

2.3 鈾的非生物沉淀

分析圖3(a)可知，試驗組A和C在不添加S.pasteurii的條件下，培養(yǎng)液與鈾在較短時間內(nèi)發(fā)生非生物沉降，隨后鈾濃度逐漸上升，過程中無明顯沉淀產(chǎn)生，說明鈾濃度下降與Ca2+的存在無顯著相關(guān)性；試驗組B中的鈾保持在較為穩(wěn)定的水平，表明S.pasteurii對鈾無顯著吸附作用，且微生物的存在很大程度抑制了鈾的非生物沉降;試驗組D的鈾濃度在短期內(nèi)迅速下降然后輕微上升并保持穩(wěn)定，過程伴隨有大量白色沉淀產(chǎn)生，說明微生物誘導的碳酸鹽沉淀對鈾產(chǎn)生了固定作用。

根據(jù)圖3(b)，添加S.pasteurii的兩個試驗組B和D短期內(nèi)pH迅速上升，原因是微生物分解尿素產(chǎn)生大量的NH+4；初期D組pH略低于B組，可能是Ca2+的存在消耗了環(huán)境中的CO23-，促進HCO-3+H++2NH+4+2OH-CO23-+2NH+4+2H2O的反應(yīng)，降低了溶液中的OH-濃度，從而導致了低pH。而A和C組pH緩慢上升是由于尿素在溶液中的自然水解。

圖3 鈾的非/生物沉淀過程中鈾濃度和pH的變化Fig.3 Changes in uranium concentration and pH during abiotic/biological precipitation processes

這些結(jié)果表明，在不存在微生物的條件下，鈾在培養(yǎng)液中會發(fā)生不穩(wěn)定的非生物沉降，但后期會逐漸釋放；而在微生物和Ca2+的共同作用下，會產(chǎn)生較穩(wěn)定的含鈾沉淀。

2.4 Ca2+濃度對固定鈾的影響

由圖4(a)可知，添加Ca2+能夠顯著降低鈾濃度，且Ca2+濃度越高，鈾濃度下降的程度越大，去除率高達95.38%。圖4(b)表明當初始Ca2+濃度為10 g/L時，Ca2+和鈾濃度先保持同步下降。隨著反應(yīng)進行到第9天，Ca2+完全沉淀，鈾濃度不再繼續(xù)下降并出現(xiàn)輕微上升，說明溶液中鈾濃度的下降與Ca2+的存在有直接關(guān)系。

圖4 Ca2+濃度對固定鈾的影響Fig.4 Effect of calcium concentration on uranium fixation

圖5(a)的結(jié)果與圖4(a)一致，高濃度Ca2+對鈾的去除率較高，前期鈾濃度下降的速度較快，后期逐漸穩(wěn)定。圖5(b)中高濃度Ca2+的試驗組大體上表現(xiàn)出較低的pH，且Ca2+濃度越高pH越低，該現(xiàn)象符合圖3(b)的推測結(jié)果，同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在Achal等[28]的研究成果中。對Ca2+添加量為1、5和10 g/L的試驗組產(chǎn)生的生物沉淀用王水消解并檢測其中的鈾含量，結(jié)果顯示鈾的含量分別為4.50、3.53和2.48 mg/g，說明初始Ca2+濃度較低的沉淀中鈾含量較高，推測原因是S.pasteurii誘導碳酸鹽沉淀過程中，后期在Ca2+充足的條件下對鈾的固定效率降低。

圖5 鈾濃度(a)和pH(b)隨時間的變化Fig.5 Changes in uranium concentration(a)and pH(b)with time

2.5 初始pH及溫度對固定鈾的影響

微生物的生長代謝以及繁殖受周圍環(huán)境pH的影響，且高pH能夠加快脲酶誘導方解石沉淀的速度[29]，因此S.pasteurii在不同初始pH條件下誘導碳酸鹽沉淀固定鈾的能力會有所差異。如圖6所示，初始pH越高，微生物誘導碳酸鹽沉淀固定鈾的速度越快，高pH有利于S.pasteurii固定水體中的鈾，但是pH為5.5~8.5的試驗組對鈾污染的修復(fù)效果沒有顯著差異。即使在初始pH為4.5的酸性條件下，微生物誘導碳酸鹽-鈾共沉淀去除鈾的效果仍然保持在較高水平，鈾的最終去除率可達95%左右，這對采用該方法修復(fù)酸性含鈾廢水提供了試驗依據(jù)。

圖6 初始pH對固定鈾的影響Fig.6 Effect of initial pH on uranium fixation

溫度也是影響微生物生長的重要因素，不同微生物具有其最適生長溫度，因此在不同溫度條件下，微生物誘導碳酸鹽沉淀修復(fù)鈾污染的能力也可能存在差異。由圖7可知，溫度對固定鈾的影響較為明顯，溫度越高，微生物誘導碳酸鹽沉淀固定鈾的速度越快，在20~40℃的溫度條件下，對修復(fù)含鈾廢水都具有較好的效果。推測是由于本文采用的微生物最適生長溫度在30℃左右，在該溫度條件下，細菌的生物量大，固定鈾的效果更好。

圖7 溫度對固定鈾的影響Fig.7 Effect of temperature on uranium immobilization

2.6 S.pasteurii誘導碳酸鹽沉淀固定鈾的機理

2.6.1 掃描電鏡-能譜分析 低濃度Ca2+產(chǎn)生的沉淀中鈾的占比較高，因此對Ca2+濃度為1 g/L時產(chǎn)生的沉淀進行掃描電鏡-能譜分析。SEM圖顯示出了清晰的晶面[圖8(a)]和類似于方解石的四面體構(gòu)型[圖8(b)][30]，晶體表面存在的微孔結(jié)構(gòu)[圖8(c)]，可能是細菌被沖刷掉后殘留的孔隙。沉淀的EDS能譜圖中出現(xiàn)了較明顯的C、O、Ca、U元素信號峰，U的質(zhì)量分數(shù)約為0.97%，說明S.pasteurii誘導碳酸鹽沉淀過程中出現(xiàn)了含鈾的沉淀產(chǎn)物。此外，利用逐級提取法檢測沉淀中鈾的化學形態(tài)，結(jié)果表明只存在可交換態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)兩種形態(tài)的鈾，其中可交換態(tài)鈾占比為4.94%，而碳酸鹽結(jié)合態(tài)占比高達95.06%。結(jié)合EDS結(jié)果分析，鈾很可能與碳酸鈣結(jié)合被固定在沉淀中。

圖8 S.pasteurii誘導碳酸鹽沉淀的SEM-EDS圖Fig.8 SEM-EDS images of carbonate precipitation induced by S.pasteurii

2.6.2 X射線衍射分析XRD分析結(jié)果（圖9）表明，S.pasteurii誘導形成的產(chǎn)物A主要以方解石晶體的形式存在。結(jié)合前文的分析結(jié)果推斷，在微生物誘導方解石形成的過程中，鈾與之共沉淀形成一種穩(wěn)定的U-方解石沉淀。同樣的研究結(jié)果也出現(xiàn)在砷(Ⅲ)污染的修復(fù)過程中[31]。

圖9 S.pasteurii誘導碳酸鹽沉淀的XRD譜圖Fig.9 XRD pattern of carbonate precipitation induced by S.pasteurii

Gabitov等[32]對氧化條件下收集到的含鈾方解石樣品進行XANES表征，結(jié)果表明樣品中的鈾與UO3相似，說明鈾處于正六價的氧化狀態(tài)。此外，X射線吸收光譜(XAS)研究發(fā)現(xiàn)，在方解石結(jié)構(gòu)中存在配合物U，U(Ⅵ)以鈾酰離子(UO2+2)并有可能以三碳酸鈾酰配合物[UO2(CO3)4-3]的形式與方解石結(jié)合，因此方解石中Ca2+和CO2-3都可能被取代[30,33]。在U(Ⅵ)摻入方解石的過程中發(fā)生了嚴重的晶格畸變，表明鈾酰離子在方解石中具有無序復(fù)雜的結(jié)構(gòu)環(huán)境[30,33]。Reeder等[30]用X射線吸收光譜和發(fā)光光譜對水溶液中鈾(Ⅵ)與方解石共沉淀物的局部結(jié)構(gòu)和配位進行了表征，研究表明在鈾與方解石共沉淀過程中，方解石的表面結(jié)構(gòu)對吸收U(Ⅵ)的能力發(fā)揮著重要的控制作用，暴露在特定方解石表面的非等效位點的相對比例強烈地影響著對鈾的吸收效率。

2.7 低濃度鈾污染修復(fù)

S.pasteurii可以誘導碳酸鹽-鈾共沉淀將高濃度鈾廢水中的鈾固存到方解石中，但是考慮到實際鈾廢水中的鈾濃度較低，因此有必要探究微生物誘導的碳酸鹽-鈾共沉淀對低濃度鈾廢水的修復(fù)效果。以1 g/L Ca2+修復(fù)1 mg/L的低濃度鈾廢水為例，7 d后取樣分析，結(jié)果顯示廢水中的鈾濃度降至274.86μg/L，該濃度低于我國《鈾礦冶輻射防護和環(huán)境保護規(guī)定》中的鈾廢水排放口濃度限值0.3 mg/L[34]，并檢測到大量白色的碳酸鹽-鈾沉淀物。

3 結(jié) 論

S.pasteurii誘導碳酸鹽-鈾共沉淀對鈾廢水具有顯著的修復(fù)作用，影響這種修復(fù)作用的最重要的因素是Ca2+濃度，充足的鈣源才能保證碳酸鈣-鈾共沉淀所需要的Ca2+；其次是pH和溫度，適宜的pH和溫度有利于微生物的繁殖代謝和提高產(chǎn)酶效率，實現(xiàn)碳酸鈣-鈾高效共沉淀。S.pasteurii誘導碳酸鹽-鈾共沉淀是一種對修復(fù)低濃度鈾廢水有潛在應(yīng)用前景的方法。

S.pasteurii誘導的碳酸鈣-鈾共沉淀在短時間內(nèi)能起到顯著的固定鈾的效果，但是自然環(huán)境條件的變化可能會影響碳酸鹽結(jié)合態(tài)的鈾的長期穩(wěn)定性，導致沉淀中鈾的再釋放。因此，為保證S.pasteurii誘導碳酸鈣-鈾共沉淀的方法修復(fù)含鈾廢水的效果，需要進一步開展構(gòu)建功能混合菌群或者采用化學穩(wěn)定劑以提高碳酸鹽-鈾共沉淀產(chǎn)物穩(wěn)定性的研究。