周惠，田志鋒，唐小微，修志龍

（1大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116024；2大連理工大學(xué)土木工程學(xué)院，遼寧大連 116024）

引 言

碳酸鈣（CaCO3）的微納米顆粒具備尺寸小、比表面積大、高空隙率等優(yōu)良特性，不僅作為填充材料廣泛應(yīng)用于涂料、塑料、油墨、造紙等領(lǐng)域[1-5]，而且因其良好的生物相容性和無(wú)毒性而用作催化劑載體、藥物輸送載體、功能材料模板、生物傳感器等，在食品工業(yè)[6-7]、生物醫(yī)學(xué)[8-10]、環(huán)境工業(yè)[11-13]等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用前景，因此碳酸鈣微納米顆粒的制備成為當(dāng)前學(xué)者們研究的熱點(diǎn)課題。CaCO3晶體可分為方解石、文石和球霰石三種不同的結(jié)晶形態(tài)，分屬三方、正交和立方晶系，其中球霰石的熱力學(xué)性質(zhì)最不穩(wěn)定，在一定條件下易轉(zhuǎn)化為方解石或文石，所以要想獲得亞穩(wěn)定的球霰石具有一定的挑戰(zhàn)性。

制備微納米CaCO3的方法有機(jī)械粉碎法、石灰乳通CO2法、可溶性碳酸鹽和鈣鹽反應(yīng)法以及微生物誘導(dǎo)沉淀法（microbially induced precipitation,MIP）。機(jī)械粉碎法是通過(guò)機(jī)械壓力加工粉碎獲得CaCO3粉末，但是這種方法難以獲得粒徑較小的CaCO3。石灰乳通CO2法與可溶性碳酸鹽和鈣鹽反應(yīng)法均可獲得粒徑較小的CaCO3，但是獲得的CaCO3顆粒分散性較差，晶型難以調(diào)控。MIP法主要應(yīng)用于巖土工程領(lǐng)域，如地基加固、裂縫修復(fù)等[14]。已有研究結(jié)果顯示，MIP法形成的CaCO3晶型主要有方解石和球霰石，粒徑在10~50μm之間[15-16]。

用可溶性碳酸鹽和鈣鹽反應(yīng)法制備微納米CaCO3時(shí)，影響CaCO3晶型、外形和尺寸的主要因素包括溫度、pH、反應(yīng)物濃度、添加劑種類等。通過(guò)改變反應(yīng)溫度可以合成不同晶型的CaCO3，溫度為2~3℃時(shí)可合成菱形方解石，25℃時(shí)合成球形球霰石，40℃時(shí)合成星形球霰石[17]。反應(yīng)體系中的碳酸根與鈣離子反應(yīng)會(huì)使溶液pH升高。隨著pH的升高CaCO3晶型會(huì)發(fā)生變化，如pH=8.0時(shí)，球霰石是CaCO3的主要晶型；而pH=13時(shí)，方解石是CaCO3的主要晶型[18]。反應(yīng)物濃度對(duì)CaCO3沉淀也有一定的影響，如溫度為30℃時(shí)，2 mmol/L的等濃度Na2CO3和CaCl2反應(yīng)可獲得空心球霰石；當(dāng)二者濃度增加至5.0 mmol/L，則可獲得純度較高的方解石聚集體；繼續(xù)增大濃度至12.5 mmol/L，獲得納米球霰石組成的實(shí)心球形CaCO3[19]。此方法為了獲得不同的CaCO3晶體，通常需要額外在反應(yīng)體系中加入氨基酸[20-21]、蛋白質(zhì)[22-23]、可溶性淀粉[19]、聚合物[24]、表面活性劑[6,25-26]等添加劑。

MIP法是利用微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的CO32-，在堿性條件下與Ca2+反應(yīng)形成CaCO3沉淀。菌體種類、培養(yǎng)基組分或代謝物的組成等都會(huì)對(duì)晶體形態(tài)產(chǎn)生重要的影響。如用不同的細(xì)菌物種可以從同一合成培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生成不同數(shù)量、形狀和類型的碳酸鹽晶體[27]。目前，脲酶分解尿素形成CaCO3沉淀是應(yīng)用最廣泛的MIP方法之一[28]。脲酶催化尿素水解為1分子氨和1分子氨基甲酸[式(1)]，氨基甲酸自發(fā)水解成氨和碳酸[式(2)]，氨和碳酸在水中進(jìn)一步離解平衡，分別形成NH4+、OH-和HCO3-、H+[式(3)和式(4)]。OH-導(dǎo)致pH增加，從而形成CO32-[式(5)]與溶液中Ca2+反應(yīng)形成CaCO3[式(6)]，反應(yīng)方程式如下：

其中，S.pasteurii作為產(chǎn)脲酶能力較強(qiáng)的細(xì)菌被廣泛研究，多數(shù)研究認(rèn)為S.pasteurii細(xì)胞表面帶有負(fù)電荷，可以提供成核位點(diǎn)，可在細(xì)胞表面形成穩(wěn)定和連續(xù)的CaCO3沉淀[29]。但是，活菌液和滅活菌液誘導(dǎo)生成的CaCO3晶型不同，活菌條件下得到直徑大于10μm的球型CaCO3，在S.pasteurii細(xì)胞表面的微環(huán)境中有納米級(jí)的碳酸鈣形成，而滅活菌液中得到的CaCO3晶體為典型的方解石[30]。單細(xì)胞水平MIP研究顯示，細(xì)胞與沉淀物共存時(shí)產(chǎn)生方解石和球霰石沉淀物[31]。更有研究顯示MIP過(guò)程中晶體形成分為三個(gè)階段，初始階段為無(wú)定形碳酸鈣和球霰石沉淀，第二階段是方解石成核以及第一階段晶體的溶解，最后階段主要是方解石的生長(zhǎng)[32]。方解石種子的存在使得形成的方解石晶體更具有不規(guī)則形狀[33]。此外，不同的鈣源對(duì)CaCO3晶體的影響更為復(fù)雜，如氯化鈣誘導(dǎo)的CaCO3多為穩(wěn)定的方解石，乙酸鈣多為片層狀的球霰石，乳酸鈣和葡萄糖酸鈣則為更復(fù)雜的堆積狀球霰石[34]。

有關(guān)細(xì)菌誘導(dǎo)CaCO3多晶型沉淀的研究不少，但是利用脲酶水解尿素制備微納米CaCO3的研究鮮有報(bào)道，無(wú)細(xì)胞的脲酶溶液誘導(dǎo)CaCO3沉淀也難以用細(xì)胞成核的觀點(diǎn)解釋。本研究利用S.pasteurii細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的產(chǎn)物制備不同形式的脲酶溶液，考察CaCO3晶型和尺寸的影響因素，為制備空心球霰石微納米CaCO3提供了一種新的方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 微生物和試劑

菌種：S.pasteuriiBNCC136654，購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物公司。

試劑：酪蛋白胨、大豆蛋白胨、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250、氯化鈉、尿素、無(wú)水氯化鈣、氫氧化鈉、瓊脂粉、鹽酸、Tris，以上試劑無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物的培養(yǎng) 將含15 g/L酪蛋白胨、5 g/L大豆蛋白胨、5 g/L氯化鈉的培養(yǎng)基在121℃高溫條件下滅菌15 min，20 g/L尿素采用過(guò)膜滅菌。接種量為1%，溫度為30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)24 h。

平板活菌計(jì)數(shù)法：將OD600=4的菌液，稀釋成不同梯度1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10，分別取不同稀釋菌液100μl用無(wú)菌涂布棒均勻涂在固體培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋梯度涂3個(gè)平板，30℃培養(yǎng)24 h，選擇合適的稀釋倍數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 不同脲酶處理液 以細(xì)菌濃度OD600=4為標(biāo)準(zhǔn)，取體積相同的發(fā)酵液（fermentation broth），離心后得上清液脲酶溶液（supernatant）；同時(shí)將菌體重懸于pH相同的Tris-HCl緩沖液中，得到菌體溶液（bacterial cell）；粗酶溶液（crude enzyme solution）是通過(guò)細(xì)胞破碎獲得的，將裝有菌體懸浮液的50 ml離心管置于冰中，在超聲破碎儀中進(jìn)行破碎（300 W，超聲4 s，間隔4 s，超聲15 min），超聲結(jié)束后，12000 r/min離心10 min，收集上清液備用。

1.2.3 CaCO3沉淀的制備 在20℃條件下，將一定濃度和體積的尿素溶液與富含脲酶的溶液先反應(yīng)30 min，之后在1200 r/min條件下邊攪拌邊加入同等濃度和體積的氯化鈣溶液，反應(yīng)一定時(shí)間后取樣，離心（12000 r/min，5 min)后用純凈水洗滌2次，去掉CaCO3表面大部分的菌體和細(xì)胞分泌物，自然干燥后進(jìn)行晶體測(cè)定及成分分析。

1.2.4 脲酶活性的測(cè)定 取1 ml菌液與9 ml 1.1 mol/L的尿素溶液混合，在30℃、pH=9的條件下反應(yīng)，用電導(dǎo)率儀測(cè)量5 min內(nèi)溶液的電導(dǎo)率變化，將電導(dǎo)率的平均變化值按式（7）計(jì)算脲酶單位時(shí)間內(nèi)水解尿素的能力（mmol/(L·min)），即可表示為單位脲酶活性（U/L）。如果脲酶活性較高，可以稀釋后測(cè)量[35]。

1.2.5 蛋白含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，取0.2 ml的待測(cè)溶液于試管中，加緩沖液至1 ml，再加入4 ml的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，靜止10 min后，在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，再與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比得出蛋白質(zhì)含量[36]。牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.6 掃描電鏡（SEM）分析 采用鎢燈絲和場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡對(duì)制備好的微納米CaCO3的形貌進(jìn)行觀察分析，取少量CaCO3樣品置于導(dǎo)電膠帶上，用氮吹儀吹去表面多余樣品，對(duì)其進(jìn)行噴金處理后測(cè)試樣品，加速電壓為20 kV，分辨率為3.0。用ImageJ軟件對(duì)CaCO3顆粒的大小進(jìn)行分析，每個(gè)樣品組取3張不同圖像，每幅圖像測(cè)量50個(gè)不同顆粒[18]。

1.2.7 X射線衍射儀（XRD）分析X射線用Cu Kα源產(chǎn)生，發(fā)射電流75 mA，電壓為12 kV，掃描范圍為2θ=3°~80°，掃描速度為10(°)/min，步長(zhǎng)0.01°，將1~3 mg的樣品放入儀器進(jìn)行測(cè)試。

根據(jù)以下公式計(jì)算不同體系中方解石和球霰石的摩爾分?jǐn)?shù)[25]：

1.2.8 傅里葉紅外光譜（FTIR）分析 將少量CaCO3粉末與KBr顆粒混合充分研磨，之后在4000~500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)以0.2 cm/s的速度收集光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同脲酶催化體系中脲酶活性和反應(yīng)過(guò)程中pH的變化

細(xì)菌濃度OD600=4時(shí)，平板活菌計(jì)數(shù)法得到細(xì)胞數(shù)為1.3×108CFU/ml。對(duì)不同脲酶催化體系中的脲酶活性和蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出脲酶的比活性，結(jié)果如表1所示。在發(fā)酵液中，脲酶比活性較低，為(4.06±0.12)U/g；而在細(xì)胞破碎后獲得的粗酶液中，脲酶比活性較高，為(6.63±0.21)U/g。這是因?yàn)殡迕甘且环N胞內(nèi)酶，細(xì)胞破碎后會(huì)釋放較多的脲酶到環(huán)境中。上清液和菌體溶液中脲酶比活性分別為(4.28±0.12)U/g和(6.05±0.01)U/g。

表1 不同溶液的脲酶活性測(cè)定結(jié)果Table 1 The results of urease activity in different solutions

對(duì)不同體系脲酶催化制備碳酸鈣（加入氯化鈣后）過(guò)程中30 min內(nèi)pH的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果如圖1所示。在加入氯化鈣的瞬間，溶液中的碳酸根與鈣離子迅速反應(yīng)，pH快速降低。發(fā)酵液和上清液催化反應(yīng)的pH變化范圍接近，在8.09~8.36之間；菌體和粗酶溶液催化反應(yīng)的pH變化范圍在8.41~8.65之間。pH的變化主要是由溶液中離子的變化引起的，菌體和粗脲酶溶液中的脲酶比活性較高，相同時(shí)間內(nèi)水解尿素產(chǎn)生的NH4+、HCO3-、OH-較多，所以導(dǎo)致反應(yīng)過(guò)程中pH偏高。

圖1 不同脲酶溶液催化反應(yīng)30 min內(nèi)的pH變化Fig.1 pH changes within 30 min during reaction catalyzed by urease in different solutions

2.2 不同脲酶溶液對(duì)CaCO3形貌和尺寸的影響

不同脲酶體系催化制備的CaCO3掃描電鏡圖（圖2）顯示，不同催化體系可以得到不同晶型的CaCO3顆粒，包括球形、方形和橢圓形。發(fā)酵液脲酶催化獲得大小不均一的球形CaCO3[圖2（a）]，粒徑均值為(3.32±0.87)μm[圖2（c）]；上清液脲酶催化獲得粒徑較為均一的球形CaCO3[圖2（b）]，粒徑均值為(1.36±0.27)μm[圖2（d）]。菌體脲酶催化獲得的CaCO3外貌表現(xiàn)為大小不一的立方體[圖2（e）]，而粗酶液催化獲得的CaCO3外貌有橢圓形和球形[圖2（f）]。CO2-3的含量會(huì)影響碳酸鈣的成核生長(zhǎng)[37]，脲酶水解尿素產(chǎn)生的CO2-3在不同時(shí)間濃度不同，與Ca2+反應(yīng)成核生長(zhǎng)時(shí)間不同，造成碳酸鈣粒徑大小不均一。

圖2 不同脲酶溶液催化獲得CaCO3沉淀的SEM圖像和粒徑分布Fig.2 SEM images and particle size distribution of CaCO3 precipitates prepared by urease in different solutions

進(jìn)一步用XRD表征不同催化體系中形成的CaCO3晶型。XRD中球霰石的特征峰在21.004°、24.972°、27.124°、32.861°、43.945°、50.269°，對(duì)應(yīng)于（004）、（110）、（112）、（114）、（300）、（118）晶面。方解石的特征峰在23.016°、29.406°、35.925°、39.381°、47.075°，對(duì)應(yīng)于（012）、（104）、（110）、（113）、（024）晶面。從圖3的XRD圖中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液和粗酶液催化獲得的CaCO3中既有方解石，又有球霰石，而上清液催化獲得的CaCO3為純球霰石，菌體催化獲得的CaCO3晶型主要為方解石。

圖3 不同脲酶溶液催化獲得CaCO3沉淀的XRD圖像（Bacterial cells/Crude enzyme solution/Fermentation broth/Supernatant分別代表菌體/粗酶液/發(fā)酵液/上清液Fig.3 XRD images of CaCO3 precipitation obtained by urease in different solutions

不同脲酶體系催化獲得的球霰石和方解石比例如表2所示，發(fā)酵液催化獲得的球霰石占比為88.10%，方解石占比為11.90%；上清液催化獲得的CaCO3均為球霰石，占比為100.00%；菌體催化獲得的方解石占比為100.00%；粗酶液催化獲得的球霰石占比為53.26%，方解石占比為46.74%。

表2 不同脲酶溶液中球霰石和方解石的占比Table 2 Proportion of vaterite and calcite by urease in different solutions

用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡對(duì)上清液催化獲得的純球霰石進(jìn)一步觀察，發(fā)現(xiàn)微米級(jí)球霰石表面是由粒徑更小的納米球霰石組成的[圖4（a）]，這些納米球霰石的平均粒徑為(25.12±4.76)nm[圖4(d)]。微米級(jí)球霰石表面為有縫隙的多孔結(jié)構(gòu)[圖4（b）]；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)由納米級(jí)球霰石組成的微米級(jí)球霰石內(nèi)部是一種中空結(jié)構(gòu)[圖4（c）]。這與Wei等[19]以淀粉為模板，在碳酸鈉和氯化鈣的濃度為2 mmol/L時(shí)形成的球霰石結(jié)構(gòu)類似。細(xì)胞的某些分泌物可能具有與淀粉類似的模板作用。此外，在粗酶液催化獲得的CaCO3中，發(fā)現(xiàn)橢圓形CaCO3表面同樣由納米球霰石組成[圖4（e）]，但尚不清楚其內(nèi)部結(jié)構(gòu)；在粗酶液和發(fā)酵液催化獲得的CaCO3中觀察到的球體包括由球形 和 層 狀CaCO3構(gòu) 成 的 球 體[圖4（f）、（g）]。S.pasteurii培養(yǎng)基中含有豐富的蛋白質(zhì)，在賦形劑對(duì)CaCO3晶體轉(zhuǎn)化的影響研究中發(fā)現(xiàn)添加酪蛋白會(huì)增加球霰石含量，其次是方解石[25]。研究顯示Ca2+濃度在0.5 mol/L時(shí)不會(huì)抑制脲酶活性，且S.pasteurii水解尿素速率的提高可誘導(dǎo)足夠量的方解石沉淀[38]。

圖4 球霰石和粗脲酶溶液催化獲得CaCO3晶體的形態(tài)Fig.4 Morphology of vaterite and CaCO3crystal prepared by crude enzyme solution

對(duì)不同脲酶體系催化制備的CaCO3進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果如圖5所示，方解石的特征吸收峰為1421、1082、876、713 cm-1，分別對(duì)應(yīng)C—O反對(duì)稱伸縮振動(dòng)、C—O對(duì)稱伸縮振動(dòng)、O—C—O面外變形振動(dòng)和O—C—O的面內(nèi)變形振動(dòng)。球霰石的特征吸收峰為1421、1082、870、750 cm-1，分別對(duì)應(yīng)C—O反對(duì)稱伸縮振動(dòng)、C—O對(duì)稱伸縮振動(dòng)、O—C—O面外變形振動(dòng)和O—C—O的面內(nèi)變形振動(dòng)。明顯觀察到粗酶液催化獲得的CaCO3晶體在1140 cm-1處含有羥基的一個(gè)強(qiáng)特征峰，可能是細(xì)胞內(nèi)富含帶有羥基的物質(zhì)。在CaCO3成核過(guò)程中，羥基對(duì)CaCO3形態(tài)的影響可以用自組裝分子外部順序的不確定性來(lái)解釋[39]。羥基自由地圍繞Cn-X鍵旋轉(zhuǎn)，但是由于氫鍵的作用，使得圍繞C鍵的羥基表面的外部順序是固定的，所以CaCO3成核朝兩個(gè)相反的方向進(jìn)行，形成橢圓型CaCO3[40]。

圖5 不同脲酶溶液催化形成的CaCO3晶體紅外譜圖Fig.5 Infrared spectra of CaCO3 precipitates

2.3 脲酶活性和反應(yīng)物濃度對(duì)球霰石的影響

脲酶活性不僅影響尿素的水解速率，而且脲酶作為一種蛋白質(zhì)對(duì)CaCO3晶體也有一定的影響。在溫度為20℃，轉(zhuǎn)速為1200 r/min，反應(yīng)物（尿素和氯化鈣）濃度為0.5 mol/L條件下，用活性分別為2、4、8、16 mmol/(L·min)的脲酶液催化制備CaCO3，分別在反應(yīng)時(shí)間<1 min內(nèi)和30 min時(shí)取樣觀察，結(jié)果如圖6所示。隨著脲酶活性的增強(qiáng)，CaCO3形態(tài)越來(lái)越規(guī)則，呈現(xiàn)為球形，而且在反應(yīng)1 min內(nèi)獲得的CaCO3形態(tài)明顯比30 min后形態(tài)更加規(guī)則，說(shuō)明脲酶活性高有利于球形球霰石晶體的形成。較低的脲酶活性可能不足以支撐CaCO3成核后保持球體的形態(tài)。

圖6 脲酶活性對(duì)球霰石的影響[(a)~(d)的反應(yīng)時(shí)間<1 min;(e)~(h)的反應(yīng)時(shí)間是30 min]Fig.6 Effect of urease activity on vaterite urease activity/(mmol/(L·min)):(a),(e)2;(b),(f)4;(c),(g)8;(d),(h)16

球霰石的粒徑與反應(yīng)物濃度有關(guān)，濃度越大，粒徑越大。為了獲得粒徑更小的球霰石，探索了反應(yīng)物濃度對(duì)粒徑的影響。在溫度為20℃、轉(zhuǎn)速為1200 r/min、脲酶活性為8 mmol/(L·min)時(shí)，反應(yīng)物（尿素和氯化鈣）濃度設(shè)為0.05、0.1、0.3、0.5 mol/L情況下制備球霰石，分別在反應(yīng)時(shí)間<1 min內(nèi)和30 min時(shí)取樣觀察，結(jié)果如圖7和圖8所示。在不同反應(yīng)物濃度中，極短時(shí)間（<1 min）內(nèi)形成的球霰石粒徑較大，30 min時(shí)球霰石粒徑較小。說(shuō)明CaCO3發(fā)生了二次成核，可能是CaCO3的自組裝或溶解和再沉淀所致[41-42]。反應(yīng)時(shí)間<1 min時(shí)，隨著反應(yīng)物濃度的增大，球霰石粒徑減小。反應(yīng)物濃度為0.05 mol/L時(shí)，球霰石平均粒徑為(11.21±1.63)μm；反應(yīng)物濃度為0.5 mol/L時(shí)，球霰石平均粒徑為(2.9±0.42)μm。而在30 min時(shí)，隨著反應(yīng)物濃度的增大，球霰石粒徑的變化較小，均在1μm左右。

圖7 反應(yīng)物濃度對(duì)球霰石的影響[(a)~(d)的反應(yīng)時(shí)間<1 min;(e)~(h)的反應(yīng)時(shí)間是30 min]Fig.7 Effect of reactant concentration on vaterite reactant concentration:(a),(e)0.05 mol/L;(b),(f)0.1 mol/L;(c),(g)0.3 mol/L;(d),(h)0.5 mol/L

圖8 不同反應(yīng)物濃度和時(shí)間對(duì)球霰石平均粒徑的影響Fig.8 Average particle size of vaterite under different reactant concentrations at<1 min and 30 min

2.4 球霰石穩(wěn)定性的探究

球霰石是一種亞穩(wěn)態(tài)晶體，并且比CaCO3其他晶型具有更高的溶解度。在水溶液中，亞穩(wěn)態(tài)的球霰石很容易在3 min內(nèi)通過(guò)溶解再結(jié)晶的方式向方解石轉(zhuǎn)化[9]。為了延長(zhǎng)球霰石的存在時(shí)間，獲得較穩(wěn)定的球霰石，往往通過(guò)加入添加劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。事實(shí)證明，無(wú)論是有機(jī)添加劑還是無(wú)機(jī)添加劑，都會(huì)對(duì)晶體的生長(zhǎng)速率起重要作用，并且可以抑制球霰石轉(zhuǎn)變?yōu)榉浇馐痆43]。

以0.5 mol/L碳酸鈉和0.5 mol/L氯化鈣化學(xué)反應(yīng)作為對(duì)照組，對(duì)脲酶溶液催化獲得的純球霰石穩(wěn)定性進(jìn)行探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在水溶液中，對(duì)照組在極短時(shí)間（<1 min）內(nèi)獲得的CaCO3有方形和球形兩種形態(tài)[圖9（a）]，而在30 min時(shí)獲得的CaCO3只有方形[圖9（b）]，在第7天和第14天獲得的CaCO3為方形聚集體[圖9（c）、（d）]。脲酶催化制備的純球霰石組中，在極短時(shí)間（<1 min）和30 min時(shí)獲得的CaCO3只有球形[圖9（e）、（f）]，直到第7天才觀察到球形CaCO3的變形體，出現(xiàn)菱形CaCO3[圖9(g)]，到第14天時(shí)球霰石全部變?yōu)榉叫蔚木奂w[圖9（h）]。

XRD圖顯示了對(duì)照組和球霰石組在不同時(shí)間的存在狀態(tài)（圖10），從上到下的XRD譜圖分別代表圖9（a）~（h）的CaCO3晶體。在對(duì)照組中，極短時(shí)間（<1 min）內(nèi)存在少量球霰石，大部分是方解石；30 min時(shí)球霰石特征峰消失，顯示均為方解石；第7天和第14天均為方解石特征峰。純球霰石組中，極短時(shí)間（<1 min）內(nèi)和30 min時(shí)，均為球霰石特征峰，無(wú)方解石特征峰存在；在第7天出現(xiàn)方解石特征峰，證明球霰石轉(zhuǎn)變?yōu)榉浇馐?；?4天球霰石的特征峰消失，溶液中均為方解石。表3顯示了對(duì)照組和純球霰石組不同時(shí)間方解石和球霰石的含量。

表3 對(duì)照組和純球霰石組在不同時(shí)間球霰石和方解石的占比Table 3 Proportion of vaterite and calcite in control group and pure vaterite group at different time

圖9 方解石和球霰石在不同時(shí)間的SEM圖(a)~(d)分別是對(duì)照組在<1 min、30 min、7 d、14 d時(shí)的晶體形態(tài);(e)~(h)分別是純球霰石組在<1 min、30 min、7 d、14 d時(shí)的晶體形態(tài)Fig.9 SEM of calcite and vaterite at different time(a)—(d)were the crystal morphology of the control group at<1 min,30 min,7 d and 14 d,respectively;(e)—(h)were the crystal morphology of the pure vaterite group at<1 min,30 min,7 d and 14 d,respectively

圖10 對(duì)照組和純球霰石組在不同時(shí)間的XRD譜圖(a)對(duì)照組,<1 min;(b)對(duì)照組,30 min;(c)對(duì)照組,7 d;(d)對(duì)照組,14 d;(e)球霰石組,<1 min;(f)球霰石組,30 min;(g)球霰石組,7 d;(h)球霰石組,14 dFig.10 XRD of control group and pure vaterite group at different time(a)control group,<1 min;(b)control group,30 min;(c)control group,7 d;(d)control group,14 d;(e)vaterite group,<1 min;(f)vaterite group,30 min;(g)vaterite group,7 d;(h)vaterite group,14 d

有研究提出CaCO3結(jié)晶的過(guò)程是由無(wú)定形CaCO3轉(zhuǎn)化為球霰石再轉(zhuǎn)化為方解石[44]。通過(guò)對(duì)球霰石穩(wěn)定性的探究，未觀察到球霰石之前的CaCO3存在形態(tài)，脲酶催化獲得的純球霰石在水溶液中存在較長(zhǎng)時(shí)間可能是細(xì)胞代謝產(chǎn)物延長(zhǎng)了球霰石向方解石轉(zhuǎn)變的時(shí)間。

3 結(jié) 論

不同脲酶溶液催化獲得的CaCO3晶體具有不同的形態(tài)。上清液和菌體酶液催化獲得的CaCO3分別為純球霰石和純方解石；發(fā)酵液催化獲得球霰石含量較多，方解石含量較少；粗酶液催化獲得球霰石和方解石含量約為1∶1。脲酶催化獲得的微米級(jí)球霰石是由納米球霰石組成，且納米球霰石之間存在孔隙。在反應(yīng)物濃度為0.5 mol/L時(shí)，脲酶活性越高越有利于球霰石的形成。脲酶活性為8 mmol/(L·min)時(shí)，極短時(shí)間（<1 min）內(nèi)球霰石粒徑隨著反應(yīng)物濃度增大而減?。?0 min時(shí)不同反應(yīng)物濃度獲得的球霰石的粒徑均為1μm左右。與化學(xué)法（碳酸鈉和氯化鈣反應(yīng)）獲得的CaCO3相比較，脲酶催化獲得的純球霰石在水溶液中可保存較長(zhǎng)時(shí)間（7 d），有利于藥物載體的開(kāi)發(fā)利用。

球霰石在藥物載體中有巨大的應(yīng)用潛力。脲酶催化可獲得由納米級(jí)球霰石組成的多孔微米球霰石，比化學(xué)法制備的球霰石更有潛力，但相比磁性復(fù)合球霰石[45]的可控性要差，具有磁性的物質(zhì)（如Fe3O4和α-Fe2O3）可通過(guò)外部磁場(chǎng)控制，實(shí)現(xiàn)磁性復(fù)合球霰石的定向移動(dòng)，而本實(shí)驗(yàn)中脲酶催化獲得的球霰石中不含磁性物質(zhì)，缺乏這種定向操控。可以借鑒硫酸鐵和氨水反應(yīng)制備磁性α-Fe2O3納米顆粒[46]加以改進(jìn)，因?yàn)槟蛩孛附鈺?huì)產(chǎn)生氨水，這部分工作將在后續(xù)研究報(bào)告中進(jìn)一步探討。