王如月，袁世力，文武武，周鵬，安淵

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是豆科多年生草本植物，適口性好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富有“牧草之王”的美稱。紫花苜蓿在我國(guó)的栽培歷史長(zhǎng)達(dá)兩千多年，近年來隨著我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展規(guī)模和水平的不斷提高，紫花苜蓿種植面積不斷擴(kuò)大，主要種植在北方地區(qū)，南方種植面積相對(duì)較小。究其原因主要是南方土壤多呈強(qiáng)酸性［1］，而紫花苜蓿適宜生長(zhǎng)在弱酸性環(huán)境（6.5～7.5）中，當(dāng)土壤pH 小于4.5 時(shí)，紫花苜蓿的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，從而限制了紫花苜蓿在南方大面積種植。李劍峰［2］的研究表明，如果單純考慮土壤酸度，紫花苜蓿適宜生長(zhǎng)的pH 為5。由此可看出，酸性土壤中影響紫花苜蓿生長(zhǎng)的因素不僅僅是pH，還有其他更重要的因素。鋁（Al）在地殼中的含量?jī)H次于氧和硅，是含量最豐富的金屬元素，占地殼總量的7.5%［3］。一般情況下，土壤中的鋁以鋁硅酸鹽化合物或氧化物的形態(tài)存在［4］，植物難以吸收。當(dāng)土壤pH 值低于5.5 時(shí)，固相態(tài)鋁釋放到土壤中以交換性鋁離子的形態(tài)存在［5］，從而對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用。鋁對(duì)植物的傷害是多方面的，典型的特征是根伸長(zhǎng)和根毛形成受到抑制［6］，從而降低根系吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，導(dǎo)致光合作用減弱，影響植物生長(zhǎng)［7］。酸性土壤中Al3+濃度的增加會(huì)與其他陽離子競(jìng)爭(zhēng)根表面質(zhì)膜的結(jié)合位點(diǎn)，從而影響營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，間接造成植物營(yíng)養(yǎng)缺乏［8］。有研究發(fā)現(xiàn)鋁可以抑制黑麥（Secale cereale）、小麥（Triticum aestivum）［9］根系對(duì)磷的吸收，導(dǎo)致缺磷癥的發(fā)生。原因是鋁離子易與土壤中的磷形成不溶于水的AlPO4，從而降低土壤溶液中的磷含量［10］。磷（phosphorus，P）是植物生長(zhǎng)發(fā)育的三大營(yíng)養(yǎng)元素之一［11］，在酸性土壤中經(jīng)常施用磷肥，以增加土壤中磷的有效性，降低鋁的毒性，例如磷能夠緩解水稻（Oryza sativa）［12］、油茶（Camellia oleifera）［13］等的鋁毒害，但也有研究認(rèn)為鋁脅迫下水稻根系分泌磷酸鹽并不能緩解鋁對(duì)水稻的毒害［14］。磷緩解植物鋁毒害的作用可能因物種和栽培方式的不同而不同。

我國(guó)長(zhǎng)江以南的酸性土壤地區(qū)有著適宜的溫度和充足的水分，可為牧草生長(zhǎng)提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境，研究紫花苜蓿對(duì)酸鋁環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，對(duì)我國(guó)南方紫花苜蓿種植以及畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究以鋁敏感型紫花苜?！甒l440’為材料，通過水培方式研究磷對(duì)紫花苜蓿鋁毒的緩解效應(yīng)，初步探究磷緩解紫花苜蓿鋁毒的機(jī)理，以期為南方紫花苜蓿栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為鋁敏感型紫花苜?！甒l440’，由北京正道有限公司提供。2018年1月將種子用蒸餾水沖洗干凈后均勻撒在浸透蒸餾水的濾紙上，并用保鮮膜封好，于25 ℃/20 ℃（白天/夜晚）、光強(qiáng)4000 lx，光照14 h 的人工氣候室中萌發(fā)培養(yǎng)。每天補(bǔ)充適量蒸餾水，確保種子浸潤(rùn)。6 d 后選取健康且長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，在莖基部用海綿包裹，固定在12 孔的泡沫板上，每孔固定6 株幼苗，置于1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液（pH=5.8）培養(yǎng)4 d，作為試驗(yàn)用苗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置CK（空白對(duì)照）、P（磷）、Al 和Al+P 4 個(gè)處理，其中，對(duì)照（CK）：將幼苗置于簡(jiǎn)易［Ca（NO3）2］營(yíng)養(yǎng)液（pH=4.5）中培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)液每2 d 更換一次。培養(yǎng)環(huán)境：溫度為25 ℃/20 ℃（白天/夜晚），光強(qiáng)為4000 lx，光照時(shí)長(zhǎng)為14 h，相對(duì)濕度為60%；磷處理（P）：在對(duì)照處理的基礎(chǔ)上，每升營(yíng)養(yǎng)液中加入200 μmol·L-1KH2PO4，該磷濃度由預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得；鋁處理（Al）：在對(duì)照處理的基礎(chǔ)上，每升營(yíng)養(yǎng)液中加入100 μmol·L-1的AlCl3；鋁加磷處理（Al+P）：在鋁處理的基礎(chǔ)上，每升營(yíng)養(yǎng)液中加入200 μmol·L-1的KH2PO4。將各處理K+濃度補(bǔ)平至200 μmol·L-1，使各處理K+濃度相同，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至4.5。每個(gè)試驗(yàn)處理均設(shè)置3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)72 株苗。處理3、7 和10 d取樣，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)定方法

根長(zhǎng)測(cè)定：采用每3 株幼苗為一個(gè)重復(fù)，用直尺測(cè)量其根長(zhǎng)，計(jì)算平均值，作為一次重復(fù)。參照Dacosta 等［15］的方法測(cè)定葉片電導(dǎo)率；采用硫代巴比妥酸（TBA）法［16］測(cè)定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法［17］測(cè)定根系活力。采用乙醇：丙酮法［18］測(cè)定葉綠素含量。以上葉片均取頂部第1～2 個(gè)復(fù)葉。鋁含量測(cè)定：處理7 d 的幼苗取樣烘干后分別準(zhǔn)確稱取葉片和根約0.1 g 左右，置于50 mL 離心管中，加入3 mL HNO3和1 mL H2O2，消煮2 h。靜置過夜后取上清液，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（Optima 8000，鉑金埃爾默）測(cè)定鋁含量。各指標(biāo)測(cè)定重復(fù)3 次。

光合氣體交換參數(shù)測(cè)定：用GFS-3000 光合熒光測(cè)定系統(tǒng)（WALZ，德國(guó)）測(cè)定光合氣體交換參數(shù)，包括凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）。將GFS-3000 光合儀預(yù)熱30 min 后設(shè)置測(cè)量參數(shù)，然后將Flow 設(shè)為750，Imp.為7。根據(jù)葉室面積，在Area 設(shè)置相應(yīng)的葉面積。相關(guān)參數(shù)設(shè)置完成后進(jìn)行ZP調(diào)0 和MP 調(diào)0，并開始測(cè)定。葉室夾上測(cè)定樣品葉片，觀察光合速率A 值穩(wěn)定后存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。每處理重復(fù)4 次。

用Imaging-PAM（WALZ，德國(guó)）測(cè)定光系統(tǒng)Ⅱ（photosystem Ⅱ，PSII）熒光參數(shù)，包括最大熒光（maximal fluorescence，F(xiàn)m），初始熒光（minimal fluorescence，F(xiàn)0），PSII 光合電子傳遞速率（the relative photosynthetic electron transport rate of photosystemⅡ，ETRII）。用Dual-PAM 100（WALZ，德國(guó)）測(cè)定光系統(tǒng)I（PSI）熒光參數(shù)，主要測(cè)定PSI 光合電子傳遞的相對(duì)速率（the relative photosynthetic electron transport rate of photosystemⅠ，ETRⅠ）。通過快速光曲線常用擬合方程P=PAR/（a·PAR2+b·PAR+c）［18］（其中，P 為快速光曲線；PAR 為光強(qiáng)）獲取擬合參數(shù)的公式為α=1/c，。其中α 為快速光曲線的初始斜率，反映了光合器官對(duì)光能的利用效率；rETRmax是擬合出來的潛在最大相對(duì)電子傳遞效率；Ik 是初始斜率線和rETRmax水平線的交點(diǎn)在坐標(biāo)橫軸上的投影點(diǎn)，代表了植物半飽和光強(qiáng)，反映植物耐受強(qiáng)光的能力［19-20］。每重復(fù)選擇3 個(gè)葉片，重復(fù)4 次。

有機(jī)酸測(cè)定：配制草酸、檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用高效液相色譜做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用高效液相色譜測(cè)定鋁處理3、6、12、24 h 后根系有機(jī)酸分泌量和鋁處理3、7 和10 h 根系有機(jī)酸含量。根系有機(jī)酸的提?。焊鶕?jù)Pellet 等［19］的方法略做修改。稱取鮮樣0.5 g，放入離心管中，加入3 mL 超純水，75 ℃水浴提取15 min，在12000 r·min-1、4 ℃下離心30 min，吸取上清液，用微孔濾膜（0.25 μm）過濾，用C-18 Sep Pack 樣品過濾柱過濾除去酚類物質(zhì)和固體顆粒，立即分析或放入冰箱（4 ℃）備用。根系分泌物收集：根據(jù)Mucha 等［20］的方法加以修改。將待測(cè)樣品根系用蒸餾水和超純水分別清洗5 次和3 次，最后將15 株幼苗的根系置于10 mL 超純水中，避光浸泡收集根分泌物6 h，然后立即用微孔濾膜過濾并冷凍干燥后，用5 mL 超純水溶解剩余殘?jiān)?，分別用C-18 Sep Pack樣品過濾柱過濾和微孔濾膜過濾，4 ℃保存?zhèn)溆?。色譜條件：Hibar column RT 250 mm×4.6 mm C18柱，填料直徑5 μmol·L-1，柱溫25 ℃，流動(dòng)相為1∶1 的0.025 mmol·L-1H2SO4和0.025 mmol·L-1KH2PO4緩沖液，使用前用微孔濾膜（0.25 μmol·L-1）過濾，流速為1 mL·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量20 μL。每重復(fù)選擇3 個(gè)葉片，重復(fù)4 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 8.1 軟件進(jìn)行方差分析和多重比較（P＜0.05）分析，使用SigmaPlot 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿根系的影響

鋁脅迫顯著抑制了紫花苜蓿根系生長(zhǎng)，而磷添加則緩解了鋁對(duì)紫花苜蓿根系生長(zhǎng)的抑制作用。與鋁處理相比，添加磷處理下的根長(zhǎng)分別增加21.95%（3 d）、36.03%（7 d）和44.33%（10 d）（圖1a）；鋁脅迫顯著降低了苜蓿根系活力，依次比對(duì)照降低22.10%（3 d）、23.31%（7 d）和31.99%（10 d），施加磷后的根系活力分別比鋁處理增加了12.83%（3 d）、16.55%（7 d）和18.06%（10 d）（圖1b）。

圖1 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿根系生長(zhǎng)和活力的影響Fig.1 Effects of phosphorus on root length and activity of alfalfa under aluminum stress

2.2 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿電導(dǎo)率和丙二醛（MDA）含量的影響

鋁脅迫顯著增加了苜蓿葉片電導(dǎo)率，依次比對(duì)照增加22.82%（3 d）、24.91%（7 d）和56.51%（10 d）。磷添加對(duì)鋁脅迫苜蓿葉片電導(dǎo)率含量有一定降低作用，比鋁處理分別降低11.55%（3 d）、9.79%（7 d）和9.99%（10 d）（圖2a）。

鋁脅迫明顯增加了苜蓿葉片的丙二醛（MDA）含量，依次比對(duì)照增加20.44%（3 d）、21.14%（7 d）和25.29%（10 d）。磷添加處理明顯緩解了鋁對(duì)葉片細(xì)胞膜的傷害，MDA 含量比鋁處理分別降低8.49%（3 d）、11.02%（7 d）和11.60%（10 d）（圖2b）。

圖2 磷對(duì)鋁脅迫下紫花苜蓿電導(dǎo)率和MDA 含量的影響Fig.2 Effects of phosphorus on the electrical conductivity and MDA content of alfalfa under aluminum stress

2.3 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿葉綠素含量的影響

由表1可知，鋁脅迫處理7 和10 d，葉綠素a 的含量顯著低于對(duì)照，分別降低14.75%（7 d）和18.11%（10 d）。處理第10 天，施加磷顯著提高鋁脅迫苜蓿葉綠素a 的含量（17.31%）。鋁脅迫對(duì)葉綠素b 含量的影響較小，對(duì)照和施加磷處理之間的差異均不顯著。

表1 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿葉綠素含量的影響Table 1 Effect of phosphorus on chlorophyll content of alfalfa under aluminum stress（μg·g-1 FW）

2.4 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿體內(nèi)鋁含量的影響

在CK 和P 處理中，紫花苜蓿根系中的Al 含量非常少，葉片中未檢測(cè)到Al 存在。磷添加明顯降低了苜蓿對(duì)鋁的吸收，根系和葉片中的鋁含量分別比鋁處理降低了81.53%和61.47%（圖3）。

圖3 磷對(duì)鋁脅迫下紫花苜蓿體內(nèi)鋁含量的影響Fig.3 Effect of phosphorus on aluminum content in root and leaves of alfalfa under aluminum stress

2.5 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿光合參數(shù)的影響

鋁脅迫顯著抑制了苜蓿葉片的蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和光合速率，磷添加對(duì)鋁脅迫苜蓿葉片的蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和光合速率產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用（表2）。與鋁處理相比，磷添加處理的蒸騰速率分別增加13.81%（3 d）、12.89%（7 d）和12.86%（10 d）；氣孔導(dǎo)度分別增加9.48%（3 d）、9.60%（7 d）和12.59%（10 d）；光合速率分別增加12.44%（3 d）、21.08%（7 d）和7.26%（10 d）。鋁脅迫顯著增加了苜蓿葉片的胞間CO2濃度，依次比對(duì)照增加11.44%（3 d）、23.42%（7 d）和25.84%（10 d），而磷添加一定程度減少了鋁脅迫苜蓿的胞間CO2濃度，依次比鋁處理減少9.24%（3 d）、7.90%（7 d）和9.53%（10 d）。

表2 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿光合參數(shù)的影響Table 2 Effects of phosphorus on photosynthetic parameters of alfalfa under aluminum stress

2.6 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿Fv/Fm的影響

鋁脅迫抑制了苜蓿最大光能轉(zhuǎn)化效率（圖4），熒光成像中，鋁脅迫下苜蓿葉片的熒光變淺，說明鋁脅迫下苜蓿幼苗葉片最大光能轉(zhuǎn)化效率有所降低。磷添加對(duì)鋁脅迫苜蓿的最大光能轉(zhuǎn)化效率具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，熒光強(qiáng)度高于Al 處理。

圖4 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿葉片F(xiàn)v/Fm的影響Fig.4 Effect of phosphorus Fv/Fm of alfalfa leaves under aluminum stress

2.7 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿光系統(tǒng)Ⅱ和光系統(tǒng)I 快速光曲線的影響

鋁脅迫抑制了苜蓿光系統(tǒng)Ⅱ和I 的相對(duì)電子傳導(dǎo)速率，而添加磷明顯促進(jìn)了鋁脅迫苜蓿光系統(tǒng)Ⅱ的相對(duì)電子傳導(dǎo)速率ETRII（圖5a）和光系統(tǒng)I 的相對(duì)電子傳導(dǎo)速率ETRI（圖5b），在918 μmol photons·m-2·s-1光強(qiáng)度下，CK、P、Al 和Al+P 處理的ETRII 值分別為14.9、14.5、8.1 和10.5 μmol·m-2·s-1；ETRI 值分別為101.9、93.8、63.9 和76.8 μmol·m-2·s-1，與Al 處理相比，P 添加對(duì)ETRII 和ETRI 的增幅分別達(dá)到29.6%和20.2%。

圖5 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿PSII 和PSI 快速光曲線的影響Fig.5 Effect of phosphorus on ETRII and ETRI of alfalfa under aluminum stress

與對(duì)照相比，鋁脅迫明顯抑制了苜蓿光系統(tǒng)Ⅱ（PSII）的光能利用效率（α）和潛在最大相對(duì)電子傳遞效 率（rETRmax）（表3），而添加磷對(duì)鋁脅迫苜蓿rETRmax值有明顯的提升作用，同時(shí)增加了鋁脅迫苜蓿PSII 的半飽和光強(qiáng)（Ik），提高了鋁脅迫苜蓿PSII 對(duì)強(qiáng)光的耐受程度和最大相對(duì)電子傳遞效率。鋁脅迫明顯抑制了光系統(tǒng)I 的rETRmax和Ik，磷添加對(duì)鋁脅迫苜蓿光系統(tǒng)I 的Ik 有一定的修復(fù)作用。

表3 紫花苜蓿光系統(tǒng)Ⅱ和光系統(tǒng)Ⅰ快速光曲線擬合參數(shù)Table 3 Fitting parameter of fast light curve of photosystem Ⅱand I in Al-stressed alfalfa

2.8 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿根系有機(jī)酸分泌和體內(nèi)有機(jī)酸含量的影響

對(duì)根系草酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸的分泌量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，鋁脅迫紫花苜蓿根系的草酸和檸檬酸分泌量在短時(shí)間（3 h）內(nèi)顯著增加，但未檢測(cè)出蘋果酸和琥珀酸（表4）。磷添加明顯降低了鋁脅迫苜蓿根系草酸和檸檬酸的分泌量，依次比鋁處理降低了27.27% 和16.00%（3 h）、27.20% 和13.14%（6 h）、20.47%和9.48%（12 h）、28.23%和12.59%（24 h）。

表4 磷對(duì)鋁脅迫紫花苜蓿根系有機(jī)酸分泌量的影響Table 4 Effect of P on organic acid secretion of alfalfa under aluminum stress（mg·mL-1）

鋁脅迫明顯降低了苜蓿根系的草酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸含量，而磷添加明顯提高了鋁脅迫苜蓿根系的草酸和蘋果酸含量（表5）。磷添加處理的根系草酸和蘋果酸含量分別比鋁處理增加了19.63%和42.72%（3 d）、7.29%和5.13%（7 d）、22.73%和284.00%（10 d）。磷對(duì)鋁脅迫苜蓿根系琥珀酸和檸檬酸含量的促進(jìn)作用不顯著。

表5 磷對(duì)鋁脅迫下紫花苜蓿根系有機(jī)酸含量的影響Table 5 Effect of P on organic acid content in alfalfa under aluminum stress（mg·mL-1）

3 討論

鋁毒是抑制酸性土壤植物生長(zhǎng)的主要因素，鋁敏感植物對(duì)鋁脅迫的最初響應(yīng)是根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而影響植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)和水分的吸收利用。磷是植物生長(zhǎng)必需的大量元素，添加200 μmol·L-1磷可明顯促進(jìn)鋁脅迫紫花苜蓿幼苗的根長(zhǎng)和根系活力，表明磷具有緩解苜蓿鋁毒害的功能。非生物脅迫下，植物細(xì)胞會(huì)受到傷害，質(zhì)膜透性增大，電解質(zhì)外滲致使電導(dǎo)率升高［21］。本研究中，鋁脅迫導(dǎo)致葉片電導(dǎo)率顯著上升，苜蓿細(xì)胞受到鋁毒傷害，而添加磷后葉片的相對(duì)電導(dǎo)率明顯低于鋁處理，表明磷可以有效緩解鋁脅迫對(duì)苜蓿葉片質(zhì)膜造成的傷害，這與王保明等［22］的研究結(jié)果一致。MDA 是積累膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量可以反映植物細(xì)胞膜的損傷程度，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)過多MDA 積累會(huì)進(jìn)一步毒害生物體［23-24］。本研究發(fā)現(xiàn)鋁脅迫使得苜蓿葉片MDA 含量增加，而添加磷后，MDA 含量顯著下降，說明磷能夠減輕鋁毒造成的細(xì)胞膜脂過氧化程度，保護(hù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能。在油茶、玉米（Zea mays）、水稻等植物的研究中也發(fā)現(xiàn)，磷對(duì)鋁脅迫造成的植物生理傷害有明顯的緩解作用［25］。

葉綠素是植物光合作用的重要物質(zhì)，承擔(dān)光能的捕獲、吸收和分配功能，影響植物的光合作用。本研究中，鋁脅迫紫花苜蓿葉綠素a 和葉綠素b 的含量下降，原因之一是Al3+與Mg2+競(jìng)爭(zhēng)質(zhì)膜的結(jié)合位點(diǎn)，影響植物對(duì)Mg2+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制了葉綠素的合成［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素a 比葉綠素b 對(duì)鋁更加敏感，這與肖祥希等［27］的研究結(jié)果一致。添加磷后，鋁脅迫紫花苜蓿葉綠素a 和葉綠素b 含量明顯提升，表明磷能夠緩解鋁脅迫對(duì)葉綠素a的傷害。氣孔和非氣孔限制都會(huì)影響植物的光合速率，氣孔限制是由氣孔導(dǎo)度下降導(dǎo)致的胞間CO2濃度降低，使暗反應(yīng)速率下降［28］；非氣孔限制主要由于凈光合速率下降所引起的胞間CO2積累，葉肉細(xì)胞對(duì)CO2的固定能力減弱，最終引起光合速率下降。本研究中，鋁脅迫導(dǎo)致紫花苜蓿蒸騰速率和光合速率下降，原因是鋁脅迫引起紫花苜蓿氣孔導(dǎo)度下降，從而降低了葉片的蒸騰作用；而胞間CO2濃度上升說明光合速率的降低并非氣孔導(dǎo)度下降導(dǎo)致CO2不足所引起，而是由于植物光合系統(tǒng)破壞，導(dǎo)致對(duì)CO2的同化能力下降所引起。添加磷后，鋁脅迫苜蓿葉片的胞間CO2濃度下降，光合速率顯著增加，表明磷降低了鋁對(duì)苜蓿葉肉細(xì)胞的傷害，增加了葉肉細(xì)胞對(duì)CO2的溶解能力，從而提高了光合速率。此外，磷添加對(duì)鋁毒導(dǎo)致的PSII 活性下降具有明顯的修復(fù)作用，提高了鋁脅迫苜蓿PSII 對(duì)強(qiáng)光的耐受程度和最大相對(duì)電子傳遞效率，從而促進(jìn)了鋁脅迫苜蓿的光化學(xué)效率、ETRII 和ETRI 的相對(duì)電子傳導(dǎo)速率。ETRI 的升高能夠有效降低鋁毒引起苜蓿葉肉細(xì)胞類囊體的電子積累數(shù)量，以及由此引起的類囊體活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增加，從而保護(hù)葉綠體結(jié)構(gòu)，提高光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的效率。

鋁脅迫下，許多植物根系分泌有機(jī)酸，并與鋁形成螯合物以減輕鋁毒，同時(shí)能夠加速土壤中磷的溶解，增加磷的有效性，鋁誘導(dǎo)苜蓿分泌的有機(jī)酸主要包括草酸、蘋果酸、檸檬酸等，其中草酸活化土壤磷的功能最強(qiáng)，其次是檸檬酸、蘋果酸。本研究發(fā)現(xiàn)鋁脅迫下紫花苜蓿根系草酸和檸檬酸的分泌量明顯增加，而且響應(yīng)十分迅速，在3～6 h，說明促進(jìn)有機(jī)酸分泌是紫花苜蓿適應(yīng)鋁脅迫的重要機(jī)制，一方面，螯合根際周圍活性鋁，降低鋁的活性和根系對(duì)鋁的吸收，另一方面，活化根際磷，促進(jìn)根系對(duì)磷的吸收，平衡體內(nèi)磷的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。許多研究表明鋁脅迫能夠誘導(dǎo)植物有機(jī)酸合成酶的活性和基因表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)根系大量分泌檸檬酸［29］。但也有研究表明植物分泌有機(jī)酸與有機(jī)酸合成酶活性無關(guān)，Yu 等［30］研究表明，鋁處理下豇豆（Vigna unguiculata）CS、蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活性均未增加，但豇豆根系仍分泌大量有機(jī)酸，抵抗鋁毒害。本研究發(fā)現(xiàn)鋁脅迫下紫花苜蓿在分泌草酸和檸檬酸的同時(shí)，根系的有機(jī)酸含量有所減少，表明鋁脅迫下苜蓿根系有機(jī)酸的合成并未增加。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)在磷的作用下，鋁脅迫紫花苜蓿有機(jī)酸的分泌量明顯減少，但根系草酸和蘋果酸含量明顯增加，說明磷促進(jìn)苜蓿耐鋁毒能力與草酸和蘋果酸合成有關(guān)，而不是通過誘導(dǎo)植物分泌有機(jī)酸來緩解鋁毒。一方面，草酸和檸檬酸可以在細(xì)胞內(nèi)與鋁形成對(duì)植物細(xì)胞無害的絡(luò)合物，從而阻止鋁與細(xì)胞成分結(jié)合，降低鋁毒害。另一方面檸檬酸、蘋果酸參與三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)，從而影響植物呼吸作用和光合作用。鋁脅迫下由于有機(jī)酸（檸檬酸、蘋果酸）含量顯著降低影響苜蓿光合代謝，而施加磷后檸檬酸、蘋果酸含量增加，光合系統(tǒng)的損傷程度降低，從而緩解了鋁毒對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的影響。

4 結(jié)論

磷處理明顯緩解了鋁對(duì)紫花苜蓿幼苗的毒害作用，光合能力、光化學(xué)效率和電子傳遞速率明顯增強(qiáng)，生長(zhǎng)速率明顯增加。添加磷引起鋁脅迫苜蓿根系草酸和蘋果酸含量增加是磷緩解苜蓿鋁毒害的主要原因之一。本研究結(jié)果揭示了磷和鋁共同作用下，紫花苜蓿生長(zhǎng)和光合生理之間的相關(guān)關(guān)系，磷通過提高根系有機(jī)酸含量，特別是草酸、檸檬酸含量改善鋁脅迫苜蓿光合生理，從而緩解苜蓿鋁毒害，為進(jìn)一步研究紫花苜蓿抗鋁毒的生理和分子機(jī)理提供了依據(jù)。