張若晨，李濤，姚祥，陳振江，李春杰*

（1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020；2.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，南京中山植物園，江蘇 南京210014）

禾草內(nèi)生真菌是指在禾草中度過(guò)全部或大部分生命周期，而禾草不顯示外部癥狀的一類真菌［1］。但是可通過(guò)組織學(xué)方法從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離出內(nèi)生真菌菌株［2-3］。關(guān)于植物內(nèi)生微生物以及植物內(nèi)生菌國(guó)際上已早有記載，但現(xiàn)代植物內(nèi)生真菌研究的基礎(chǔ)，形成于20世紀(jì)70年代林木內(nèi)生真菌和禾本科植物內(nèi)生真菌研究［4-6］。隨著研究領(lǐng)域的不斷拓寬和研究方法的不斷深入，禾草內(nèi)生真菌的研究進(jìn)入了快速發(fā)展階段，其范疇不斷擴(kuò)大，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域中都具有很大的應(yīng)用潛力，而且禾草內(nèi)生真菌的研究?jī)?nèi)涵也在不斷豐富，發(fā)揮了重要的生態(tài)和生理作用及其可作為潛在的生防資源和外源基因的載體［7-8］，這些使得禾草內(nèi)生真菌已逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［9］。近幾十年研究指出大部分禾本科植物均存在內(nèi)生真菌［7］，禾草內(nèi)生真菌可以促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)植物的光合作用、合成植物激素［10］，除此之外禾草內(nèi)生真菌還可以提高寄主植物的各種抗逆性，例如耐旱性［11］、耐鹽性［12］、耐寒性［13］、抗病性［14］，并且能夠促進(jìn)禾本科植物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、還可以提高牧草產(chǎn)量［15］。

禾草內(nèi)生真菌與宿主植物形成互惠互利共生體，而且絕大多數(shù)的內(nèi)生真菌在宿主植物內(nèi)會(huì)產(chǎn)生生物堿，對(duì)于生物堿的研究最早可以追溯到1944年，人們發(fā)現(xiàn)羊采食了黑麥草（Lolium perenne）后會(huì)出現(xiàn)類似麥角中毒的癥狀，Cunningham 等［16］報(bào)道稱，引起家畜出現(xiàn)中毒癥狀的多年生黑麥草并沒有被任何病害所侵染的跡象，此后又有多篇高羊茅（Festuca arundinacea）導(dǎo)致家畜中毒的報(bào)道問世［17］。20世紀(jì)60年代，人們從黑麥草和高羊茅等禾草中分離出了多種生物堿［18］。但是此后幾年內(nèi)國(guó)際上關(guān)于禾草內(nèi)生真菌共生體使家畜中毒的原因與機(jī)制等方面的研究與報(bào)道較少［19］。直到20世紀(jì)70年代，人們又發(fā)現(xiàn)了感染內(nèi)生真菌的一些禾本科植物如高羊茅、黑麥草等會(huì)引起牛、羊等家畜中毒，因此，對(duì)禾草內(nèi)生真菌和生物堿生物學(xué)作用方面的研究逐漸引起大家的重視［20］。1981年報(bào)道了綿羊黑麥草結(jié)節(jié)病的暴發(fā)與多年生黑麥草中的兩種神經(jīng)毒素有關(guān)，這兩種黑麥草中的代謝產(chǎn)物被分別命名為L(zhǎng)olitrem A 和Lolitrem B［21］。之后，新西蘭與美國(guó)先后報(bào)道了高羊茅與黑麥草中內(nèi)生真菌產(chǎn)生的數(shù)種生物堿，他們對(duì)內(nèi)生真菌生物堿的研究大都集中在生物堿的分離、純化、鑒別以及分子結(jié)構(gòu)等方面［18］。20世紀(jì)初，Li等［22］發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)北部廣泛分布著一種對(duì)家畜具有毒性和麻醉性的禾草，即醉馬草（Achnatherum inebrians），且他們發(fā)現(xiàn)醉馬草對(duì)動(dòng)物的毒性由甘肅內(nèi)生真菌（Epichlo? gansuensis）的代謝產(chǎn)物導(dǎo)致。2006年，Song 等［23］發(fā)現(xiàn)，被內(nèi)生真菌感染的醉馬草中含有大量的麥角堿類生物堿，包括麥角堿和麥角新堿。2007年，Zhang 等［24］發(fā)現(xiàn)，披堿草（Elymus dahuricus）內(nèi)生真菌共生體可以產(chǎn)生波胺，且產(chǎn)堿量呈季節(jié)性變化，在10月最多，在6月幾乎不產(chǎn)生生物堿。2011年Zhang 等［25］研究了刈割頻率和刈割高度對(duì)于醉馬草產(chǎn)生生物堿含量的影響；同年他又發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫或干旱脅迫下，醉馬草內(nèi)生真菌共生體仍會(huì)保持較高的產(chǎn)堿量，且麥角新堿比麥角堿的產(chǎn)量高［26］。2014年，Zhang 等［27］又發(fā)現(xiàn)，麥角生物堿對(duì)動(dòng)物平滑肌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，且生物堿濃度越大，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用就越強(qiáng)。2015年，Zhou 等［28］評(píng)估了溫度對(duì)3 種生態(tài)型中華羊茅（Festuca sinensis）麥角生物堿產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)麥角堿和麥角新堿在短期的寒冷脅迫下會(huì)發(fā)生改變。2017年，Ekanayake 等［29］通過(guò)對(duì)高羊茅內(nèi)生真菌共生體產(chǎn)生生物堿的基因組和代謝特征的研究，指出了通過(guò)DNA 分析發(fā)現(xiàn)和初步鑒定的內(nèi)生真菌，進(jìn)行代謝驗(yàn)證研究，這種方法可以提高產(chǎn)堿的速度和效率。2018年，Li 等［30］發(fā)現(xiàn)，白粉病和土壤水分條件顯著影響醉馬草內(nèi)生真菌共生體的麥角堿產(chǎn)量。2019年，Lin 等［31］發(fā)現(xiàn)，季節(jié)變化和生態(tài)型對(duì)中華羊茅內(nèi)生真菌共生體產(chǎn)堿量均有影響，且季節(jié)變化對(duì)生物堿濃度的影響比生態(tài)型更為顯著。2020年，Cagnano 等［32］對(duì)歐洲不同地點(diǎn)收集的受Epichlo?屬內(nèi)生真菌感染的禾本科植物進(jìn)行基因分型測(cè)序（genotyping-by-sequencing），深入研究了寄主和內(nèi)生真菌的遺傳結(jié)構(gòu)及其相互作用，結(jié)果表明，在植物和內(nèi)生真菌亞群中，洛林生物堿和菌絲體生物量的濃度是相關(guān)的，并且存在個(gè)體差異。此外，Cagnano 等［32］還對(duì)基因分型測(cè)序是否值得用于Epichlo?屬內(nèi)生真菌-禾草共生體做出了探討，發(fā)現(xiàn)最大的限制是內(nèi)生真菌對(duì)植物閱讀的數(shù)量不成比例地低，因?yàn)檎婢锪窟h(yuǎn)遠(yuǎn)低于植物生物量。同年，Cagnano 等［33］研究發(fā)現(xiàn)，近紅外光譜法和化學(xué)計(jì)量學(xué)的結(jié)合使用可以定量檢測(cè)禾草內(nèi)生真菌共生體中的洛林生物堿含量和菌絲生物量。2019年，Caradus 等［34］綜述了麥角堿濃度對(duì)新西蘭牧草和反芻動(dòng)物放牧草地的影響，論證了人工接種可以得到不表達(dá)麥角纈氨酸但仍產(chǎn)生麥角堿的內(nèi)生真菌菌株，也就是對(duì)放牧動(dòng)物低毒性且具有抗蟲性的禾草內(nèi)生真菌共生體。

目前人們發(fā)現(xiàn)的與禾草內(nèi)生真菌有關(guān)的生物堿已有數(shù)10 種，例如，從黑麥草和草甸羊茅（Festuca pratensis）中分離的內(nèi)生真菌分別可產(chǎn)生震顫素（Lolitrem B）［35］和黑麥草堿（Lolines）［36］，從醉馬草中分離的甘肅內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生麥角酰胺和麥角新堿［37］。這些生物堿主要可以分為4 類，分別是吡咯并吡嗪類，代表物為波胺；麥角堿類，代表物有麥角堿和麥角新堿；吲哚雙萜類，代表物有震顫素；以及飽和吡咯化合物，代表物主要是黑麥草堿［18］。

大多數(shù)生物堿對(duì)生物都具有毒性，只有波胺對(duì)哺乳動(dòng)物沒有毒性，而其中毒性最強(qiáng)的是麥角堿類和吲哚雙萜類生物堿［38］。被內(nèi)生真菌感染的高羊茅、黑麥草與醉馬草通常會(huì)產(chǎn)生多種麥角堿，它不僅使所采食的動(dòng)物中毒，還可改變動(dòng)物的生理指標(biāo)（體重、體溫、血液中激素含量、肌肉纖維產(chǎn)量等），嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡。其中麥角新堿是導(dǎo)致家畜中毒的重要毒素，主要是因?yàn)辂溄切聣A對(duì)動(dòng)物平滑肌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用［27］。另一方面，雖然生物堿普遍具有毒性，但有研究表明，禾草內(nèi)生真菌產(chǎn)生的生物堿可以增強(qiáng)寄主的抗逆性，如抗蟲［39］、抗干旱等［40-42］。同時(shí)生物堿也阻止了家畜和草食性野生動(dòng)物等對(duì)禾草的采食，起到了對(duì)物種多樣性的保護(hù)作用［43］。而且生物堿還可增加寄主植物對(duì)于某些線蟲的抵抗能力，在帶有內(nèi)生真菌的高羊茅生長(zhǎng)的土壤內(nèi)，多種線蟲的群體數(shù)量均明顯低于不帶有內(nèi)生真菌禾草生長(zhǎng)的土壤［44］。因此，在人為的調(diào)控下，有望將各種優(yōu)勢(shì)繼續(xù)擴(kuò)大，使它在生物農(nóng)業(yè)方面大放異彩。

我國(guó)植物內(nèi)生真菌生物堿的研究始于20世紀(jì)90年代，并且在近年內(nèi)對(duì)內(nèi)生真菌生物堿展開一系列研究，發(fā)表了大量的文章，但是國(guó)內(nèi)對(duì)于內(nèi)生真菌生物堿的研究大多集中于藥用植物和谷類作物［18］，對(duì)于禾本科植物內(nèi)生真菌共生體產(chǎn)生生物堿的研究卻相對(duì)較少，相反國(guó)外近年來(lái)十分關(guān)注對(duì)禾本科植物以及Epichlo?屬內(nèi)生真菌的研究。因此，對(duì)于這一領(lǐng)域文獻(xiàn)的計(jì)量統(tǒng)計(jì)分析，將有利于了解其發(fā)展?fàn)顩r。鑒于目前國(guó)內(nèi)沒有禾草內(nèi)生真菌生物堿相關(guān)的文獻(xiàn)計(jì)量分析，因此，本研究對(duì)2000-2019年這20年間Web of Science 數(shù)據(jù)庫(kù)中的禾草內(nèi)生真菌生物堿文章進(jìn)行計(jì)量分析，旨在了解當(dāng)前關(guān)于國(guó)際上禾草內(nèi)生真菌生物堿研究的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)，為我國(guó)從事禾草內(nèi)生真菌生物堿研究的各位科技工作者提供參考。

1 材料與方法

文獻(xiàn)來(lái)自Web of Science 數(shù)據(jù)庫(kù)（包括Web of Science 核心合集、BIOSISI Previews、KCI-Korean Journal Database、Russian Science Citation Index、sciELO Citation Index 5 個(gè)庫(kù)），采用基本檢索的方式，以“Epichlo?，alkaloids”或者“Neotyphodium，alkaloids”為關(guān)鍵詞，檢索該數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)2000-2019年間與禾草內(nèi)生真菌生物堿有關(guān)的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)記錄。經(jīng)過(guò)篩選以后得到646 篇相關(guān)文獻(xiàn)。本研究將對(duì)這些文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，主要分析指標(biāo)有：發(fā)文所屬國(guó)家、發(fā)文數(shù)量歷年變化趨勢(shì)、文章研究方向、發(fā)文所屬機(jī)構(gòu)、文獻(xiàn)來(lái)源、文獻(xiàn)被引用頻次以及H 因子（hindex）等。其中H 因子是一個(gè)評(píng)價(jià)學(xué)術(shù)成就的新指標(biāo)，它是指一名科研人員（國(guó)家或機(jī)構(gòu)）至多有h 篇論文分別被引用了至少h 次。h 指數(shù)越高，則表明論文影響力越大。而文獻(xiàn)被引頻次則客觀地反映了總體被使用和受重視的程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 國(guó)際發(fā)文數(shù)量與所屬國(guó)家分析

2000-2019年，Web of Science 數(shù)據(jù)庫(kù)收錄與禾草內(nèi)生真菌生物堿研究相關(guān)的文獻(xiàn)總計(jì)646 篇，統(tǒng)計(jì)了發(fā)文所屬國(guó)家，共有36 個(gè)。然后，選取了發(fā)文數(shù)量前10 的國(guó)家進(jìn)行分析（表1）。發(fā)現(xiàn)在發(fā)文數(shù)量與h-index 方面，美國(guó)、新西蘭兩國(guó)大幅領(lǐng)先其他國(guó)家，說(shuō)明這兩國(guó)在禾草內(nèi)生真菌生物堿領(lǐng)域的研究進(jìn)展與影響力處于國(guó)際頂尖水平。而平均被引次數(shù)卻是中國(guó)（包括檢索結(jié)果中的“China”與“Peoples Republic of China”）、德國(guó)和加拿大最多，說(shuō)明中國(guó)、德國(guó)與加拿大也是關(guān)于禾草內(nèi)生真菌生物堿研究的主要力量。

表1 2000-2019年發(fā)表禾草內(nèi)生真菌生物堿文章數(shù)量前10 國(guó)家Table 1 Top 10 countries publishing articles on alkaloids of grass endophytic fungi from 2000 to 2019

相較于美國(guó)、新西蘭等國(guó)家，我國(guó)關(guān)于禾草內(nèi)生真菌生物堿的研究開始較晚，21世紀(jì)以后我國(guó)才開始此方面的研究，但是我國(guó)內(nèi)生真菌生物堿的研究發(fā)展迅速，尤其是2011年后，相關(guān)文章數(shù)量明顯增加（圖1）。國(guó)內(nèi)最早關(guān)于禾草內(nèi)生真菌生物堿的介紹是Tan 等［45］2001年發(fā)表在Natural Product Reports 期刊（農(nóng)林一區(qū)，IF2018=11.88）的《Endophytes：A rich source of functional metabolites》。該文章中主要介紹了3 種禾草內(nèi)生真菌生物堿的分子結(jié)構(gòu)、毒性及其來(lái)源，分別是胺類與酰胺類生物堿，吲哚衍生物類生物堿（這類生物堿對(duì)昆蟲和哺乳動(dòng)物有毒），以及吡咯烷類生物堿，以上生物堿均產(chǎn)生于內(nèi)生真菌感染的禾草中，其中有些生物堿可以作為殺蟲劑，但對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性較?。?5］。此后數(shù)年，Tan 及其團(tuán)隊(duì)未對(duì)禾草內(nèi)生真菌生物堿進(jìn)行繼續(xù)研究。而我國(guó)禾草內(nèi)生真菌生物堿的研究領(lǐng)域內(nèi)，南志標(biāo)院士團(tuán)隊(duì)研究最為系統(tǒng)深入，發(fā)文量最多，推動(dòng)了國(guó)內(nèi)禾草內(nèi)生真菌生物堿的研究，使這方面的研究從此進(jìn)入快速發(fā)展的階段。

圖1 2000-2019年前三國(guó)家發(fā)文量年動(dòng)態(tài)Fig.1 The dynamic of top 3 countries publishing articles on grass endophytic fungi during 2000 to 2019

2.2 相關(guān)發(fā)表文章所屬機(jī)構(gòu)分析

對(duì)檢索出的關(guān)于內(nèi)生真菌生物堿研究的646 篇科技論文，按照其所屬科研機(jī)構(gòu)進(jìn)行分類，然后選取發(fā)文量前十的機(jī)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表2），目前對(duì)于禾草內(nèi)生真菌生物堿研究主要集中在高校和科研院所，其中肯塔基大學(xué)、西弗吉尼亞大學(xué)、梅西大學(xué)與蘭州大學(xué)等對(duì)于內(nèi)生真菌生物堿的研究較為深入，美國(guó)農(nóng)業(yè)部與新西蘭農(nóng)業(yè)部對(duì)于內(nèi)生真菌生物堿的研究較為重視。而且發(fā)文數(shù)量最多的幾個(gè)機(jī)構(gòu)分別屬于美國(guó)、新西蘭和中國(guó)，說(shuō)明這3 個(gè)國(guó)家在該領(lǐng)域的研究處于世界前列。

表2 2000-2019年禾草內(nèi)生真菌生物堿文章數(shù)量前10 機(jī)構(gòu)Table 2 Top 10 institutions of publishing articles on alkaloids of grass endophytic fungi from 2000 to 2019

隨后本研究對(duì)國(guó)內(nèi)的33 篇生物堿相關(guān)文章進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖2），發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)對(duì)于禾草內(nèi)生真菌生物堿的研究主要集中在高校，其中蘭州大學(xué)對(duì)禾草內(nèi)生真菌生物堿的研究最為深入和系統(tǒng)，共發(fā)表了23 篇相關(guān)文章，研究方向主要包括生物堿的提取和檢測(cè)方法、生物堿的合成機(jī)理、生物堿對(duì)家畜的毒性、生物堿的組織分布、季節(jié)變化以及生物堿對(duì)共生體的生理生態(tài)作用等。20世紀(jì)國(guó)際上已對(duì)禾草內(nèi)生真菌生物堿展開一系列的研究，研究報(bào)道主要集中在羊茅屬禾草［46-48］、多年生黑麥草［1］以及睡眠草（Achnatherum robustum）［49］等。而21世紀(jì)以來(lái)，南志標(biāo)院士團(tuán)隊(duì)擴(kuò)展了對(duì)禾草內(nèi)生真菌生物堿的研究范圍，開始對(duì)醉馬草［50-51］、披堿草［52］、野大麥（Hordeum brevisubulatum）［12，53］和中華羊茅［28，31］中的生物堿進(jìn)行研究。

圖2 2000-2019年國(guó)內(nèi)機(jī)構(gòu)發(fā)文情況Fig.2 The dynamic of domestic institutions publishing articles on grass endophytic fungi during 2000 to 2019

2.3 我國(guó)與國(guó)際發(fā)表文章的研究方向?qū)Ρ确治?/h3>

目前關(guān)于內(nèi)生真菌生物堿的研究已經(jīng)延伸到了各個(gè)行業(yè)，包括植物科學(xué)、微生物學(xué)、化學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)、基因?qū)W、病理與藥理學(xué)等幾十個(gè)研究方向，現(xiàn)在對(duì)檢索出的關(guān)于內(nèi)生真菌生物堿研究的646 篇科技論文，按照其研究方向進(jìn)行分類（由于出現(xiàn)學(xué)科交叉現(xiàn)象，所以各個(gè)分類文章相加大于總數(shù)），選取發(fā)文量前10 的研究領(lǐng)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表3）。其中關(guān)于植物科學(xué)（plant science）方面的論文數(shù)量最多，有526 篇，占總發(fā)文量的81.42%。而且禾草內(nèi)生真菌生物堿相關(guān)的研究涉及范圍非常廣，主要集中在農(nóng)學(xué)、環(huán)境生態(tài)學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域。

表3 2000-2019年國(guó)際禾草內(nèi)生真菌生物堿研究方向Table 3 Research areas on alkaloids of grass endophyte fungi from 2000 to 2019

而我國(guó)相關(guān)領(lǐng)域的33 篇文章中，最多的研究方向也是植物科學(xué)，有29 篇與之相關(guān)。我國(guó)關(guān)于內(nèi)生真菌生物堿的研究主要集中在真菌學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、農(nóng)學(xué)、環(huán)境生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域，與國(guó)際目前的總體研究趨勢(shì)一致。

2.4 我國(guó)相關(guān)文章的被引用情況統(tǒng)計(jì)分析

我國(guó)禾草內(nèi)生真菌生物堿相關(guān)文章被引頻次（包括自引）為67.67，遠(yuǎn)高于國(guó)際平均水平（24.63），說(shuō)明我國(guó)的文章在國(guó)內(nèi)外具有較高認(rèn)可度。因此，本部分統(tǒng)計(jì)了我國(guó)被引用頻次最高的6 篇文章（表4），并對(duì)其進(jìn)行分析。其中《Endophytes：A rich source of functional metabolites》被引用的次數(shù)最多，有922 次，該研究主要介紹了內(nèi)生真菌代謝物與生物堿的生物學(xué)特性，指出內(nèi)生真菌是一種豐富可靠的生物活性和化學(xué)新化合物來(lái)源，具有巨大的藥用和農(nóng)業(yè)潛力，除了介紹禾草內(nèi)生真菌生物堿以外，還介紹了其他多種內(nèi)生真菌代謝物，因此被學(xué)者們廣泛引用。而且從表中可以看出國(guó)內(nèi)被引用前幾的文章主要是介紹生物堿的生物學(xué)特征，生態(tài)作用以及影響禾草植物產(chǎn)堿量的因素。

表4 2000-2019年我國(guó)禾草內(nèi)生真菌生物堿被引頻次最高的6 篇文章Table 4 Top 6 most cited articles in the field of alkaloids of grass endophyte fungi in China from 2000 to 2019

2.5 我國(guó)相關(guān)文章的文獻(xiàn)來(lái)源統(tǒng)計(jì)分析

收錄我國(guó)的33 篇相關(guān)文章的期刊一共有25 個(gè)，再次說(shuō)明了我國(guó)目前關(guān)于內(nèi)生真菌生物堿的研究涉足領(lǐng)域十分廣泛。目前國(guó)內(nèi)發(fā)表在Natural Product Reports 的兩篇文章，即《Endophytes：A rich source of functional metabolites》和《Biology and chemistry of endophytes》，是中國(guó)學(xué)者以第一作者的身份在禾草內(nèi)生真菌生物堿領(lǐng)域所發(fā)表的影響因子最高的兩篇文章，影響因子為11.876。收錄我國(guó)該領(lǐng)域內(nèi)文章最多的期刊是Frontiers in Microbiology，收錄了3 篇文章。我國(guó)禾草內(nèi)生真菌生物堿文章所發(fā)表的期刊影響因子多在2～4，影響因子在0～2 次之，而影響因子在4～6 以及影響因子＞6 的文章則相對(duì)較少（圖3）。對(duì)收錄國(guó)內(nèi)禾草內(nèi)生真菌生物堿文章的期刊進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)表我國(guó)文章超過(guò)一篇的期刊有7 個(gè)（表5），說(shuō)明隨著國(guó)內(nèi)對(duì)于生物堿研究的不斷深入，我國(guó)文章所發(fā)表的期刊水平逐年提高，陸續(xù)有文章發(fā)表于Journal of Agricultural and Food Chemistry（農(nóng)林一區(qū)）、Natural Product Reports（化學(xué)一區(qū)）等高水平期刊。

圖3 2000-2019年我國(guó)禾草內(nèi)生真菌論文影響因子分布Fig.3 Distribution of impact factors of the articles on grass endophyte fungi published by Chinese scientists during 2000 to 2019

表5 2000—2019年我國(guó)內(nèi)生真菌生物堿文章期刊（發(fā)表文章超過(guò)一篇）分布Table 5 The distribution of journals（publishing more than one article）on alkaloids of grass endophyte fungi in China during 2000 to 2019

3 總結(jié)與展望

目前由于真菌學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和基因遺傳學(xué)的快速發(fā)展，以及近年來(lái)植物內(nèi)生真菌生物堿在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的作用越來(lái)越受到重視，使得人們對(duì)于禾草內(nèi)生真菌生物堿的研究取得了突破性的進(jìn)展。比如，生物堿使宿主產(chǎn)生抗性的機(jī)制；不同禾草內(nèi)生真菌共生體產(chǎn)生生物堿的類型及其對(duì)家畜的毒性作用；影響生物堿在植物中分布特點(diǎn)及濃度的因素；生物堿的人工合成途徑等方面。

我國(guó)的禾草內(nèi)生真菌生物堿研究已取得很大的進(jìn)步，但國(guó)內(nèi)的研究大都從21世紀(jì)初才開始，因此，關(guān)于禾草內(nèi)生真菌生物堿的研究仍與美國(guó)、新西蘭等國(guó)家存在差距。所以提出以下幾方面建議，望研究者們可以克服困難，使我國(guó)禾草內(nèi)生真菌生物堿的研究更加系統(tǒng)完善。

一、現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)的研究雖然拓寬了對(duì)禾草內(nèi)生真菌生物堿的研究領(lǐng)域，但是關(guān)于生物堿的基礎(chǔ)研究相較于國(guó)外仍然比較薄弱，因此，研究者應(yīng)對(duì)生物堿基礎(chǔ)方面進(jìn)行更為深入的研究。

目前國(guó)內(nèi)生物堿使宿主植物產(chǎn)生抗性機(jī)制的研究大多是在受控環(huán)境中進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果可能只能證明寄主某種抗性的一般趨勢(shì)，田間的情況可能與實(shí)驗(yàn)室中的記錄存在差異。例如，抗蟲性試驗(yàn)過(guò)程中模擬的植物施肥、土壤水分和溫度條件都是對(duì)植物生長(zhǎng)最有利的，這些因素都可能影響禾草內(nèi)生真菌共生體與昆蟲的相互作用結(jié)果，使試驗(yàn)結(jié)果不能準(zhǔn)確反映田間禾草內(nèi)生菌共生體對(duì)昆蟲的影響［54］。因此，建議下一階段重點(diǎn)研究在不受控制的真實(shí)田間環(huán)境下，探究生物堿對(duì)于宿主植物產(chǎn)生抗性的影響。

國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究證明環(huán)境溫度和生物堿的劑量會(huì)影響生物堿中毒的發(fā)生，以及洛林生物堿是通過(guò)阻斷鉀離子與神經(jīng)膜受體相互作用的通道致使家畜中毒［55］。但是生物堿對(duì)動(dòng)物的毒性作用尚未完全清楚，而且對(duì)目前已知的4 種生物堿的致毒機(jī)理尚無(wú)更深入的研究。因此，接下來(lái)的此類研究應(yīng)該著重從生物堿致毒機(jī)理方面入手，例如，從植物和動(dòng)物組織中提取出生物堿進(jìn)行離體研究，這可能為進(jìn)一步揭示其致毒機(jī)理提供更多研究線索，為以后內(nèi)生真菌的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

國(guó)內(nèi)的研究者雖然進(jìn)行了一系列影響植物中生物堿含量因素的研究（包括鹽脅迫、干旱脅迫、刈割頻率與刈割高度、寒冷脅迫以及季節(jié)變化的影響），但都是初步探討，建議對(duì)這方面進(jìn)行更多的研究，得到更為深入和有益的結(jié)果，為我國(guó)研究者進(jìn)一步探索禾草內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

二、通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)近20年的禾草內(nèi)生真菌生物堿研究文章進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)對(duì)于生物堿的定性和定量分析都是用高效液相色譜法或氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定，這些方法測(cè)定結(jié)果固然準(zhǔn)確，但是時(shí)間成本和人工成本相對(duì)較高。由于近紅外光譜已經(jīng)廣泛用于牧草的常規(guī)分析，因此，國(guó)際上有研究建立了一種對(duì)洛林生物堿進(jìn)行快速檢測(cè)和定量分析的新型方法，此方法基于近紅外光譜法（near infrared spectroscopy，NIRS），加上改進(jìn)的偏最小二乘法，利用獲得的近紅外光譜建立了植物真菌生物量和生物堿含量的定量預(yù)測(cè)方程，最終定量計(jì)算禾草內(nèi)生真菌樣品中的洛林生物堿含量和菌絲生物量［33］。而且為篩選和分離得到自然產(chǎn)生的動(dòng)物友好型菌株，以便日后再次接種優(yōu)良品種，研究者必須對(duì)禾草內(nèi)生真菌共生體進(jìn)行大規(guī)模篩選，并對(duì)菌株進(jìn)行特征描述和生物堿測(cè)定。相比國(guó)內(nèi)研究大多采用的全基因組測(cè)序的方法，國(guó)外有研究采用的基因分型測(cè)序（genotyping-by-sequencing），其成本更低，更適合于大量的個(gè)體［32］。有關(guān)禾草內(nèi)生真菌生物堿鑒定、定量分析、基因測(cè)序以及增加產(chǎn)量等方面的新技術(shù)和新方法的應(yīng)用，減少了研究的成本，同時(shí)提高了效率。但是在目前統(tǒng)計(jì)的國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)中，這些新技術(shù)和新方法很少被研究，因此建議國(guó)內(nèi)研究者在加強(qiáng)對(duì)生物堿基礎(chǔ)研究的同時(shí)，適當(dāng)引入新的試驗(yàn)技術(shù)和研究方法，以更加明確內(nèi)生真菌和宿主禾草之間的相互作用，加速人工接種以提高生物堿產(chǎn)量方面的研究，并為基因組關(guān)聯(lián)的研究鋪平道路。

三、近年來(lái)為提高生物堿的產(chǎn)量，使其更好地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域，使得生物堿的生物合成和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)逐漸成為該領(lǐng)域研究和關(guān)注的重點(diǎn)。目前在生物堿合成方面的研究雖有進(jìn)展，但是對(duì)于生物堿的生物學(xué)特性仍需更加深入的研究。由于生物堿的成分復(fù)雜，分離純化的成本高，因此，有必要利用新興的合成生物學(xué)研究人工合成的方法。目前現(xiàn)有的細(xì)胞工廠中已經(jīng)構(gòu)建了麥角生物堿的部分生物合成途徑，并產(chǎn)生了相應(yīng)的中間產(chǎn)物。但是這些中間產(chǎn)物產(chǎn)率很低而且與最終產(chǎn)物相差甚遠(yuǎn)。所以進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞工廠途徑、基因組編輯、提高工程宿主的酶活性和適應(yīng)性、增加前體供應(yīng)等是提高產(chǎn)量的關(guān)鍵［56］。我國(guó)亟待利用代謝工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)生物堿的高效、大規(guī)模生產(chǎn)。

四、關(guān)于內(nèi)生真菌生物堿的研究已經(jīng)延伸到了各個(gè)行業(yè)，真菌學(xué)與其他學(xué)科間的相互協(xié)同與交叉研究已是目前研究的潮流與趨勢(shì)，通過(guò)基因遺傳學(xué)和植物科學(xué)的研究明確內(nèi)生真菌與寄主植物的相互關(guān)系，推動(dòng)了生物堿的發(fā)展。因此，建議國(guó)內(nèi)未來(lái)的研究調(diào)查增加生物堿或產(chǎn)生生物堿的遺傳潛力的測(cè)試，評(píng)估Epichlo?和相關(guān)內(nèi)生真菌的農(nóng)業(yè)生態(tài)意義，加強(qiáng)生物堿與其他學(xué)科之間的共同研究。