從 叢，魏霞臻，譚國(guó)琴

1.長(zhǎng)安大學(xué)醫(yī)院，陜西 西安 710064；2.西安交通大學(xué)陜西天奎生物醫(yī)藥科技有限公司，陜西 西安 710061；3.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四五醫(yī)院，四川 雅安 625000

骨質(zhì)疏松癥是中老年人的常見(jiàn)性疾病，尤其是絕經(jīng)后女性由于卵巢功能減退，機(jī)體內(nèi)的雌激素水平下降，使骨吸收超過(guò)骨形成，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生［1-2］。研究顯示，絕經(jīng)后女性因雌激素缺乏引起的全身骨密度降低與頜骨骨組織礦化物丟失密切相關(guān)，并且可進(jìn)一步導(dǎo)致牙槽骨高度和密度的降低［3］。在骨組織微環(huán)境中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1和腫瘤壞死因子TNF-α與骨組織的形成和吸收關(guān)系密切，它們對(duì)骨代謝過(guò)程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化、增殖及功能活性的調(diào)控具有重要意義［4-5］。SXZG是以沙棘油脂肪酸以及棕櫚酸等不飽和脂肪酸為主要成分的中成藥，前期研究已經(jīng)證實(shí)SXZG可以降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病，抗組織細(xì)胞衰老，改善血流流變性，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及免疫功能，但是其是否可以防治絕經(jīng)后頜骨骨量丟失、牙槽骨骨質(zhì)疏松目前還沒(méi)有研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制作去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠下頜骨磨牙區(qū)牙槽骨免疫組化染色切片，觀察用藥后大鼠下頜牙槽骨中TGF-β1及TNF-α的表達(dá)變化，推斷SXZG藥物對(duì)去卵巢大鼠牙槽骨的作用。

1 動(dòng)物模型和研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇8月齡SD雌性大鼠60只，3月齡SD雌性大鼠10只，平均體重為（290±20）g；均為SPF（無(wú)特殊病原體）級(jí)；動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2009-0004，由北京醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠、標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，溫度保持在21±2℃，濕度維持在65%±5%，可自由攝食、攝水。記錄進(jìn)食量，攝水量。

1.2 制備動(dòng)物模型

（1）用隨機(jī)抓取發(fā)法在60只SD大鼠中選取50只作為去勢(shì)組，10只為假手術(shù)組。（2）將2%戊巴比妥鈉注入去勢(shì)組50只大鼠的腹腔內(nèi)進(jìn)行全麻，摘除大鼠雙側(cè)卵巢，術(shù)后分層縫合肌肉及皮膚；假手術(shù)組的10只大鼠在被全麻后則只打開(kāi)腹腔，而并不切卵巢，術(shù)后將肌肉及皮膚分層縫合。（3）手術(shù)3個(gè)月后，隨機(jī)抽取去勢(shì)組大鼠10只，與假手術(shù)組的10只大鼠比較，用雙光子骨密度測(cè)定儀（美國(guó)HOLOGIC）檢測(cè)大鼠脛骨、腰椎、股骨三個(gè)部位的的骨密度。用SPSS 19.0軟件對(duì)骨密度數(shù)據(jù)進(jìn)行兩樣本均數(shù)比較的配對(duì)t檢驗(yàn)，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩組間脛骨、股骨骨密度比較P＜0.05，腰椎骨密度比較P＜0.01，表明去勢(shì)組骨密度與假手術(shù)組相比，其骨密度顯著下降，脛骨，股骨，腰椎的骨密度比較均具有顯著性差異，說(shuō)明骨質(zhì)疏松模型建模成功。

1.3 研究方法

將50只去勢(shì)大鼠隨機(jī)分為五組，每組10只，其中四組分別灌藥喂服不同的藥物，即實(shí)驗(yàn)藥物SXZG劑量1，SXZG劑量2，己烯雌酚片，仙靈骨葆膠囊，剩下一組去勢(shì)模型組與假手術(shù)組喂服空白乳劑，另設(shè)一組10只3月齡SD雌性大鼠為青年對(duì)照組，喂服空白乳劑，最終共計(jì)七組，SXZG藥物由西安交通大學(xué)天奎生物醫(yī)藥科技有限公司供，己烯雌酚購(gòu)自合肥久連制藥有限公司，仙靈骨葆膠囊購(gòu)自貴州同濟(jì)堂制藥有限公司，分組如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠分組

1.4 下頜骨免疫組化染色觀察

解剖分離出下頜骨，置于4%甲醛中固定一周，固定后將下頜骨放入EDTΑ脫鈣液（0.5 mol/L，pH=7.0）中充分脫鈣8周，脫鈣后截取下頜骨第三磨牙及周圍牙槽骨，梯度酒精脫水，二甲苯透明，進(jìn)行組織浸蠟與包埋，制作第三磨牙區(qū)骨組織連續(xù)切片。將石蠟切片按照試劑說(shuō)明操作步驟分別進(jìn)行TGF-β1及TNF-α免疫組化染色，樹(shù)膠封片，普通光鏡下觀察免疫組化染色情況。將所有免疫組化切片經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica TCS SP2型）照相，每個(gè)切片取3個(gè)視野，采用西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院motic med 6.0數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每個(gè)視野的陽(yáng)性染色灰度，并計(jì)算平均灰度值。兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體及兔抗鼠TNF-α多克隆抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠牙槽骨TGF-β1及TNF-α免疫組化染色觀察

免疫組化結(jié)果以胞漿呈棕黃色染色為陽(yáng)性表達(dá)，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)各組大鼠牙槽骨中TGF-β1及TNF-α在骨小梁周圍的成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞以及骨基質(zhì)中有不同程度的表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠牙槽骨中TGF-β1及TNF-α的表達(dá)

2.2 各組大鼠牙槽骨中TGF-β1及TNF-α表達(dá)灰度值比較

灰度值是對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)強(qiáng)弱的體現(xiàn)，其數(shù)值越大，表示細(xì)胞因子表達(dá)的量越小。本實(shí)驗(yàn)中，不同組別牙槽骨中TGF-β1及TNF-α的表達(dá)不同，去勢(shì)組E組與假手術(shù)組F組相比，牙槽骨中TGF-β1表達(dá)明顯減少（P＜0.05），TNF-α表達(dá)明顯增多（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組、B組牙槽骨中TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)均較E組增多（P＜0.05），TNF-α陽(yáng)性表達(dá)均較E組減少（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組、B組牙槽骨中TGF-β1及TNF-α的陽(yáng)性表達(dá)與假手術(shù)組F組相比，差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組C組與D組牙槽骨中TGF-β1表達(dá)均高于E組（P＜0.05），TNF-α表達(dá)均有所降低（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠牙槽骨中TGF-β1及TNF-α表達(dá)灰度值

3 討論

臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，雌激素長(zhǎng)期缺乏不僅導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，還可造成牙槽骨丟失，即絕經(jīng)后婦女在發(fā)生全身性骨質(zhì)疏松時(shí)往往伴隨頜骨及牙槽骨的骨質(zhì)疏松［6］。有學(xué)者研究認(rèn)為［7］，骨質(zhì)疏松癥患者相較于非骨質(zhì)疏松癥患者，更易發(fā)生牙齒附著喪失和牙槽骨喪失，且絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥女性牙周炎的發(fā)生率和嚴(yán)重程度會(huì)明顯增加。在骨代謝過(guò)程中，有許多細(xì)胞因子參與骨吸收和骨形成的調(diào)控，其中有些細(xì)胞因子可以促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化和成熟，增加破骨細(xì)胞的活性，使骨吸收增加；有些細(xì)胞因子可抑制破骨細(xì)胞的增殖及激活，增加骨形成。 TGF-β1對(duì)骨代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用，TGF-β1能促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)骨膜間充質(zhì)細(xì)胞增殖、分化為成骨細(xì)胞，并刺激Ⅰ型膠原合成，促進(jìn)成骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成和鈣化，從而調(diào)控骨組織改建，對(duì)骨形成具有重要意義［8-10］。李凝旭等對(duì)135名絕經(jīng)后女性研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清中TGF-β1的含量較正常者降低［11］。本實(shí)驗(yàn)中，TGF-β1在大鼠牙槽骨的成骨細(xì)胞、部分骨細(xì)胞以及骨基質(zhì)有表達(dá)，與假手術(shù)組相比，去勢(shì)組大鼠牙槽骨中TGF-β1表達(dá)減少，說(shuō)明大鼠摘除卵巢后，隨著雌激素水平的降低，牙槽骨的成骨活動(dòng)到抑制；經(jīng)SXZG藥物治療后，大鼠牙槽骨中TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)較去勢(shì)組增多，說(shuō)明SXZG藥物可以增加去卵巢大鼠牙槽骨的形成。

TNF-α是破骨細(xì)胞因子，有學(xué)者認(rèn)為TNF-α是刺激骨吸收所必需的，TNF-α可直接作用于破骨細(xì)胞，刺激骨吸收，也可抑制骨膠原的表達(dá)及成骨細(xì)胞的分化，通過(guò)增加骨膠原酶的分泌使骨基質(zhì)加速降解，進(jìn)而影響骨形成［12］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［13］，絕經(jīng)后雌激素缺乏可引起血清TNF-α等細(xì)胞因子水平的升高。亦動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［14］，小鼠切除卵巢后，雌激素水平降低，T細(xì)胞分泌的TNF-α明顯增加， TNF-α可促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和骨吸收。本實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組相比，去勢(shì)組牙槽骨中TNF-α的表達(dá)增多，說(shuō)明大鼠在摘除卵巢后，隨著雌激素水平的下降，TNF-α介導(dǎo)的牙槽骨骨吸收活動(dòng)增強(qiáng)，經(jīng)SXZG藥物治療后，SXZG劑量1組、SXZG劑量2組牙槽骨中TNF-α陽(yáng)性表達(dá)均較去勢(shì)組減少，說(shuō)明SXZG藥物可抑制去卵巢大鼠牙槽骨的骨吸收活動(dòng)。

綜上所述，SXZG可增加去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨中成骨細(xì)胞因子TGF-β1的表達(dá)，減少牙槽骨中破骨細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)，以此推論SXZG藥物對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨骨質(zhì)破壞有抑制作用，可預(yù)防因雌激素水平下降導(dǎo)致的槽骨骨量減少。