李洪波,匡 黎

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院腫瘤科，湖北十堰 431017

結(jié)直腸癌(CRC)是從結(jié)腸或直腸發(fā)展而來的癌癥，年齡增加、不良生活方式和潛在遺傳性疾病都是其影響因素[1]。一些遺傳性疾病也是導(dǎo)致誘發(fā)結(jié)直腸癌的原因，包括家族性腺瘤性息肉病(FAP)和遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(HNPCC)[2-3]?，F(xiàn)階段，可以通過在結(jié)腸鏡檢查期間獲取結(jié)直腸樣本來診斷CRC，然后通過醫(yī)學(xué)成像來確定疾病是否擴(kuò)散[4]，但目前尚未完全預(yù)防和控制CRC。近期研究主要集中于白細(xì)胞介素(IL)介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡、遷移或侵襲的影響，或IL這類炎癥相關(guān)指標(biāo)對(duì)其他疾病(胃癌)易感性及其預(yù)后的影響，目前暫無詳盡結(jié)直腸癌多樣性的相關(guān)研究[5-7]。有報(bào)道顯示，IL-17和IL-23R的某些等位基因可能與結(jié)直腸癌腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)，故本研究針對(duì)IL-17和IL-23R基因多樣性與CRC易感性展開研究，現(xiàn)報(bào)道如下[8]。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年5月至2019年5月于本院進(jìn)行治療的140例CRC患者設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。其中男78例，女62例，年齡31～68歲，平均(47.19±8.56)歲。實(shí)驗(yàn)組中結(jié)腸癌(CC)患者78例，直腸癌(RC)患者62例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ期44例，Ⅳ期38例；腫瘤位于升結(jié)腸42例，橫結(jié)腸34例，降結(jié)腸34例，直腸30例；腺癌120例，黏液腺癌14例，印戒細(xì)胞癌6例，其中中高分化50例，低分化90例；平均病程(5.64±2.11)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合CRC診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，年滿18周歲，首次接受治療，有病檢樣本，臨床和診斷治療齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：患胃部疾病(胃鏡確診)，有胃腸道手術(shù)史，有惡性腫瘤病史，對(duì)治療藥物過敏者，有近期相關(guān)治療史者。另外選取2014年5月至2017年5月于本院進(jìn)行體檢的100例體檢健康者作為對(duì)照組，其中男54例，女46例，年齡32～69歲，平均(47.56±8.49)歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本次研究對(duì)象選取及其后續(xù)實(shí)驗(yàn)均受本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，全部患者均自愿參與。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1DNA樣收集 于清晨(9:00前)抽取所有被研究對(duì)象的外周靜脈血2 mL，加入抗凝劑(EDTA-K2)后4 ℃下離心分離得到血細(xì)胞，使用試劑盒(GenElute，Sigma-Aldrich，美國(guó))抽提血細(xì)胞DNA，然后利用瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)DNA純度和完整度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2基因多態(tài)性檢驗(yàn) 利用聚合酶聯(lián)反應(yīng)-連接酶反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)(PCR-LDR)檢驗(yàn)IL-17A/F和IL-23R基因多態(tài)性，其中IL-17A rs2275913位點(diǎn)的擴(kuò)增長(zhǎng)度為494 bp，上游引物為5′-CGG AAT TGT CTC CAC AAC AC-3′；下游引物為5′-CAG GAG TCA TCG TTG TTT CT-3′，特異性引物擴(kuò)增IL-17A基因的目的基因片段。IL-17Frs763780位點(diǎn)的擴(kuò)增長(zhǎng)度為401 bp，上游引物為5′-GCA AAC AAA CAC CTG AAG TA-3′；下游引物為5′-GTT CCC ATC CAG CAA GAG AC-3′，特異性引物擴(kuò)增IL-17F基因的目的基因片段。IL-23Rrs10889677位點(diǎn)的擴(kuò)增長(zhǎng)度為453 bp，上游引物為5′-CAA TCT TGT TTC CAG AGT AGT GAC-3′,下游引物為5′-AAA AAT ACA TGA GGC GTC CA-3′。具體操作如下：引物和探針由上海百研生物科技公司完成合成，將DNA樣本稀釋至10 ng/μL后加1 μL至反應(yīng)體系(包含引物混合物1 μL，Master mix 5 μL和3 μL ddH2O)。置入PCR儀，94 ℃下2 min變性后，進(jìn)行11個(gè)94 ℃(20 s)-65 ℃(40 s)-72 ℃(60 s)的循環(huán)，在進(jìn)入94 ℃(20 s)-59 ℃(30 s)-72 ℃(90 s)的24個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 120 s。隨后加入1 μL Exol/SAP酶，37 ℃下恒溫1 h后滅活。使用試劑盒進(jìn)行雙鏈接反應(yīng)，將稀釋后的連接產(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè)序，使用DNAman9.0分析數(shù)據(jù)。IL-17A選擇rs2275913位點(diǎn)，IL-17F選擇rs763780位點(diǎn)，IL-23R選擇rs10889677位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1高通量測(cè)序序列基本信息 使用illuminate平臺(tái)目的基因高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，數(shù)據(jù)獲取剔除低質(zhì)量reads后進(jìn)行拼接，所獲Tags平均拼接率約為95.00%，結(jié)果較為理想，見表1。

表1 高通量測(cè)序序列基本信息

2.2兩組IL-17A基因及其等位基因頻率比較 兩組IL-17A(rs2275913)TT、TC和CC分布情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組IL-17F(rs763780)TT、TC和CC分布情況與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但其等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組IL-17A/F基因及其等位基因頻率比較[n(%)]

2.3兩組IL-23R基因及其等位基因頻率比較 實(shí)驗(yàn)組IL-23R(rs10889677)TT、TC和CC分布情況與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但其等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 兩組IL-23R基因及其等位基因頻率比較[n(%)]

2.4IL-17F和IL-23R多態(tài)性與CRC患者臨床表現(xiàn)間的關(guān)系 IL-17F(rs763780)單核苷酸基因頻率與腫瘤分期相關(guān)，純合子TT在中重度患者中分布明顯少于輕度患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且腫瘤位于升結(jié)腸的純合子TT基因頻率明顯異于其他部位，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IL-23R(rs10889677)位點(diǎn)單核苷酸基因頻率與腫瘤分期及腫瘤部位差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。Logistic回歸分析顯示，IL-17F(rs763780)Ⅲ、Ⅳ期患者中TT基因型明顯異于其他(CT+CC)基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；腫瘤位于升結(jié)腸患者中IL-23R(rs10889677)CC基因型明顯異于其他(TT+TC)基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表4 同臨床表現(xiàn)患者IL-17F和IL-23R等位基因及其突變的比較(n)

表5 IL-17F和IL-23R多態(tài)性與CRC患者臨床表現(xiàn)間的關(guān)系(95%CI)

3 討 論

IL-17和IL-23都是促炎性細(xì)胞因子，IL-17由T輔助細(xì)胞17產(chǎn)生，以響應(yīng)IL-23得到刺激[10]。近期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)IL-17和IL-23R的某些等位基因可能與結(jié)直腸癌腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)[11]。在IL-17家族成員中，IL-17F同種型1和2(ML-1)與IL-17A具有最高的序列同源性(分別為55%和40%)[1-3]。但是針對(duì)IL-17F的研究相對(duì)于IL-17A而言較少，且其在癌癥發(fā)展中的作用尚不明確；另一方面，現(xiàn)階段研究主要集中于IL-17F募集炎癥因子、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子或干預(yù)腫瘤血管生成方向[13]。此外，其他IL(如IL-1s、IL-8和IL-10等)雖然介導(dǎo)炎性反應(yīng)，但未有明確結(jié)果證明他們基因的多態(tài)性影響腫瘤易感性。本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組IL-17F的rs763780位點(diǎn)和IL-23R的rs10889677位點(diǎn)基因頻率分布與對(duì)照組存在明顯差異，這提示臨床工作者IL-17F和IL-23R基因多態(tài)性可能和結(jié)腸癌存在一定的相關(guān)性。裴芳等[14]研究顯示病毒性心肌炎IL-17A多態(tài)位點(diǎn)AA基因型和A等位基因頻率均顯著高于對(duì)照組，這與本研究的結(jié)果類似。同時(shí)，IL-23被證明可以促進(jìn)許多其他免疫病理學(xué)模型中的炎癥發(fā)展，包括關(guān)節(jié)炎模型，腸道炎癥和牛皮癬；其中IL-23R作為IL-23信號(hào)傳遞因子也被證實(shí)與疾病易感性相關(guān)，與本研究結(jié)果一致[15]。

本研究結(jié)果顯示，IL-17F(rs763780)單核苷酸基因頻率與腫瘤分期相關(guān)，純合子TT在中重度患者中分布明顯少于輕度患者，且腫瘤位于升結(jié)腸的純合子TT基因頻率明顯異于其他部位。因而本文推測(cè)，IL-17F的rs763780位點(diǎn)T向C的改變，可能增加CRC易感性；同理，IL-23R的rs10889677位點(diǎn)TC向CC的改變，也有可能是腫瘤位于升結(jié)腸的標(biāo)志。研究表明，IL-23可以刺激Th17細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和維持，而IL-23與存在于T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和DC細(xì)胞上的IL-23R結(jié)合，介導(dǎo)這些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，故其控制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[15-16]。而Th17細(xì)胞得到生長(zhǎng)、增殖和分化又會(huì)產(chǎn)生大量IL-17，從而形成IL-23/IL-23R/Th-17/IL-17通路。這些反應(yīng)引起細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄異常，從而引發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[17-18]。另一方面，本研究指出IL-17F rs763780位點(diǎn)和IL-23R rs10889677基因多態(tài)性與CRC病癥相關(guān)，但本文僅針對(duì)該基因上的一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行研究，下一步，本文也需要多位點(diǎn)分析，收集更多臨床治療，分析患者年齡和血清各指標(biāo)參數(shù)等與IL-17A/F和IL-23R不同基因型與臨床特征的差異。同時(shí)，本文分析了CC和RC患者IL-17A/F和IL-23R間時(shí)候存在基因頻率差異，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。

綜上所述，IL-17F(rs763780)和IL-23R(rs10889677)可能影響結(jié)直腸癌患者的易感性，其多核苷酸多態(tài)性分別與患者腫瘤分期、腫瘤部位相關(guān)。