李光苗 陳 飛 王 燕

（邢臺市婦幼保健院婦產(chǎn)科，邢臺 054000）

妊娠期高血壓疾?。╤ypertensive disorders complicating pregnancy，HDCP）是孕婦妊娠時出現(xiàn)的一種常見疾病，其病情與新生兒不良結(jié)局發(fā)生率呈正相關(guān)，可影響胎兒及新生兒生長發(fā)育，嚴(yán)重者會出現(xiàn)死胎、早產(chǎn)、窒息等合并癥[1]。HDCP隨著時間推移，孕婦胎盤內(nèi)的絨毛血管結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，絨毛纖維化增多、數(shù)量下降，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)血管閉塞，使得胎盤血流量減少，進(jìn)一步影響胎兒的發(fā)育[2-3]。目前研究表明缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）、可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1（soluble fms-like tyrosine kinase receptor 1，sFLT-1）均參與HDCP的發(fā)生，HIF-1α是缺氧狀態(tài)下細(xì)胞分泌的核蛋白，與相關(guān)靶基因VEGF等結(jié)合后可促進(jìn)血管新生，sFLT-1則與其功能相反，可抑制VEGF信號通路活性，導(dǎo)致血管新生障礙，胎盤絨毛完整性、通透性受到影響[4-5]。HDCP臨床治療中主要以硫酸鎂為主，但硫酸鎂毒性較大[6]，因此需要尋找替代硫酸鎂的新型治療藥。丹參川芎嗪注射液具有多種藥理作用[7]，但關(guān)于丹參川芎嗪注射液對HDCP大鼠胎盤組織的作用研究較少。由此，本研究探討丹參川芎嗪與硫酸鎂對HDCP大鼠的治療效果及對胎盤組織中HIF-1α、sFLT-1的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

RT-PCR試劑盒（上海 優(yōu)予）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RPMI-1640培養(yǎng)基（上海 一研）。Wistar大鼠雌性80只，雄性40只，體質(zhì)量225 g±26 g，購自南京 CAVENS生物技術(shù)有限公司，11～13周齡。

1.2 HDCP大鼠模型建立及分組

將135只大鼠于干凈環(huán)境下飼養(yǎng)，于大鼠發(fā)情期時將2只雌鼠與1只雄鼠放于同一籠內(nèi)過夜，第2天清晨發(fā)現(xiàn)陰道栓脫落大鼠記為妊娠第1天，共計(jì)有41只大鼠妊娠成功，妊娠第2天對其中30只大鼠尾靜脈注射一氧化氮合成酶抑制劑（L-NAME）建立妊娠期高血壓大鼠模型，注射持續(xù)至妊娠14 d，期間注射劑量125 mg/kg，1次/日。

將30只HDCP大鼠分為HDCP組、硫酸鎂組，丹參組，每組10只，其余11只作為對照組。HDCP組、對照組大鼠于妊娠第17天于尾靜脈分別腹腔注射5.0 mg·kg-1·d-1生理鹽水、硫酸鎂組大鼠腹腔注射60 mg·kg-1·d-1硫酸鎂，丹參組大鼠腹腔注射10 mg·kg-1·d-1的丹參川芎嗪注射液，持續(xù)至妊娠第19天，記錄3組大鼠妊娠第14天、19天動脈收縮壓及24 h尿蛋白測量結(jié)果，所有大鼠在12～17 d后均表現(xiàn)為收縮壓及24 h尿蛋白升高，大鼠建模后均給予藥物治療。

1.3 胎鼠發(fā)育情況

將飼養(yǎng)至第21天的各組大鼠給予乙醚麻醉，剖宮將胎鼠取出，記錄胎鼠的身長，并對胎鼠、胎盤質(zhì)量和死胎的情況進(jìn)行記錄。

1.4 H-E染色觀察胎盤病理形態(tài)

取大鼠胎盤組織，甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋后切片4 μm，中性樹膠封片，蘇木精和伊紅染色液分別復(fù)染6～8 min、10 s，于顯微鏡下觀察各組胎盤組織結(jié)構(gòu)改變情況。

1.5 RT-PCR檢測HIF-1α、sFLT-1 mRNA表達(dá)變化

將胰蛋白酶加入大鼠胎盤組織中進(jìn)行消化反應(yīng)，PBS沖洗，然后滴入0.9%NaCl溶液，采用TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，按試劑盒說明書操作。用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對HIF-1α、sFLT-1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，引物序列見表1，內(nèi)參采用β-actin。PCR反應(yīng)條件為60℃，10 min、95℃、72℃，各 30 s、95℃，5 min，循環(huán)次數(shù)40，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用相對定量2-ΔΔCT計(jì)算HIF-1α、sFLT-1表達(dá)。

表1 引物序列

1.6 免疫印跡檢測HIF-1α、sFLT-1蛋白表達(dá)

取胎盤組織，PBS溶液洗滌后，切碎處理加入1 mL裂解液，提取組織中總蛋白測定濃度，在100 V SDS-PAGE對總蛋白進(jìn)行電泳，蛋白樣品采用Bradford法定量，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用10%的山羊血清，封閉0.5 h，分別加入一抗HIF-1α、sFLT-1（1∶2 000）。4℃孵育過夜，二抗常溫孵育1 h（1∶2 000），β-actin 作內(nèi)參，TBST沖洗后，ECL顯色，BOX型凝膠成像系統(tǒng)檢測掃描，檢測HIF-1α、sFLT-1蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析或χ2檢驗(yàn)，組間兩兩比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓、尿蛋白比較

與對照組相比，其余3組大鼠血壓、尿蛋白值均升高，說明HDCP建模成功；與HDCP組相比，硫酸鎂組、丹參組大鼠血壓、尿蛋白值下降明顯（P<0.05），硫酸鎂組與丹參組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

表2 各組大鼠血壓和尿蛋白比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠血壓和尿蛋白比較（n=10，±s）

*P<0.05 vs對照組；△P<0.05 vs HDCP組；#P<0.05 vs硫酸鎂組；▲P<0.05 vs同組治療前

組別 血壓（mmHg） 尿蛋白（mg/mL）干預(yù)前 干預(yù)后 干預(yù)前 干預(yù)后對照組 101.77±3.60 101.87±3.37 167.67±12.82 169.06±18.02 HDCP組 143.03±3.84* 142.65±3.42* 630.41±13.11* 628.74±22.21*硫酸鎂組 142.91±3.77* 126.32±3.48*△▲ 629.35±12.75* 449.59±17.23*△▲丹參組 143.06±3.57* 120.61±3.51*△#▲ 629.92±13.03* 428.37±16.39*△#▲

2.2 各組胎鼠發(fā)育情況

對照組胎鼠、胎盤質(zhì)量均高于HDCP組、丹參組（P<0.05）；與HDCP組比較，硫酸鎂組、丹參組胎鼠及胎盤質(zhì)量明顯增加（P<0.05）；對照組無死胎，硫酸鎂組大鼠死胎率為10.5%（9/85），丹參組為6.98%（6/86），均明顯低于HDCP組的19.05%（16/84）（P<0.05）（表3）。

表3 各組胎鼠發(fā)育情況（n=10，±s，g）

表3 各組胎鼠發(fā)育情況（n=10，±s，g）

*P<0.05 vs對照組；△P<0.05 vs HDCP組；#P<0.05 vs硫酸鎂組

組別 胎鼠質(zhì)量 胎盤質(zhì)量對照組 4.55±0.45 0.63±0.10 HDCP組 2.81±0.33* 0.42±0.08*硫酸鎂組 4.33±0.36*△ 0.50±0.09*△丹參組 4.45±0.32*△# 0.58±0.08*△#

2.3 各組大鼠胎盤組織形態(tài)變化

H-E染色結(jié)果顯示，對照組胎盤結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞完整；HDCP組出現(xiàn)胎盤結(jié)構(gòu)萎縮，絨毛數(shù)目顯著減少，有壞死的絨毛纖維素樣出現(xiàn)，細(xì)胞異常增殖；丹參組胎盤組織結(jié)構(gòu)異常減輕，壞死絨毛纖維素樣減少，且優(yōu)于硫酸鎂組（圖1）。

圖1 各組大鼠胎盤組織形態(tài)變化，H-E染色，標(biāo)尺=50 μm

2.4 各組胎盤組織HIF-1α、sFLT-1 mRNA水平變化

RT-PCR法檢測顯示，與對照組比較，HDCP組胎盤組織HIF-1α、sFLT-1 mRNA水平明顯升高（P<0.05）；與HDCP組比較，硫酸鎂組及丹參組HIF-1α、sFLT-1 mRNA水平明顯下降（P<0.05），且丹參組低于硫酸鎂組（P<0.05，圖2）。

圖2 各組大鼠胎盤組織HIF-1α、sFLT-1 mRNA表達(dá)水平變化

2.5 各組胎盤組織HIF-1α、sFLT-1蛋白表達(dá)變化

免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，HDCP組胎盤組織HIF-1α、sFLT-1蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與HDCP組比較，硫酸鎂組及丹參組HIF-1α、sFLT-1蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.05），且丹參組低于硫酸鎂組（P<0.05，圖3）。

圖3 各組大鼠胎盤組織HIF-1α、sFLT-1蛋白表達(dá)水平變化

3 討論

HDCP是導(dǎo)致孕婦與圍產(chǎn)兒死亡率較高的主要原因之一，其病理表現(xiàn)為水腫、血壓升高、蛋白尿等[8]。目前HDCP的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，國內(nèi)外相關(guān)的研究數(shù)據(jù)也存在差異。因此，產(chǎn)前準(zhǔn)確判斷孕婦是否患有HDCP，可降低孕產(chǎn)婦和新生兒患病概率[9]。目前尚無確切有效的方法治療HDCP，降壓藥物可以有效降低孕婦血壓，但降壓藥物均可通過胎盤被胎兒吸收，影響胎兒妊娠結(jié)局[10-11]。丹參川芎嗪注射液中含有丹參、鹽酸川芎嗪等，均具有明顯降壓、抗炎、抗纖維化作用，近年來在治療HDCP中得到了廣泛應(yīng)用[12]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，其余3組大鼠血壓、尿蛋白值均升高，說明HDCP建模成功。與HDCP組相比，硫酸鎂組及丹參組大鼠血壓、尿蛋白值下降明顯。對照組胎鼠、胎盤質(zhì)量均高于HDCP組、丹參組，與HDCP組比較，硫酸鎂組、丹參組胎鼠及胎盤質(zhì)量明顯增加，且死胎率明顯降低。臨床常用硫酸鎂改善患者血壓，雖然其可以有效降低孕婦血壓，但其藥物成分可通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，對胎兒的發(fā)育產(chǎn)生一定的危害[13-14]。有研究證實(shí)，HDCP患者胎盤功能的異常變化，胎盤血管呈異常收縮痙攣狀態(tài)，對胎兒的發(fā)育造成極大影響，嚴(yán)重時可能會出現(xiàn)胎死宮內(nèi)[15]。相關(guān)文獻(xiàn)報道，丹參川芎嗪注射液中的川芎嗪可影響胎盤血流量增加，對影響胎盤發(fā)育的血栓烷A分泌有明顯的抑制作用[16]。川芎嗪是一種從川芎根莖分離的生物堿類，以往研究證實(shí)能夠改善心腦血管疾病，對胎盤組織血流動力學(xué)產(chǎn)生影響，HDCP導(dǎo)致的胎盤組織血氧供應(yīng)不足，川芎嗪能夠滋養(yǎng)細(xì)胞基膜，增加絨毛血管基膜厚度和胎盤組織血流灌注，而丹參是擴(kuò)張血管、促進(jìn)血液循環(huán)的良藥，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性，有利于胎盤發(fā)育，同時對纖維蛋白溶解有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，改善胎盤血流狀態(tài)及微循環(huán)障礙[17]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相符。

本研究對照組胎盤結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞完整，HDCP組出現(xiàn)胎盤結(jié)構(gòu)萎縮，絨毛數(shù)目顯著減少，有壞死的絨毛纖維素樣出現(xiàn)，細(xì)胞異常增殖，丹參組胎盤結(jié)構(gòu)異常減輕，壞死絨毛纖維素樣減少，且優(yōu)于硫酸鎂組。與對照組比較，HDCP組胎盤組織HIF-1α、sFLT-1 mRNA及蛋白水平明顯升高，與HDCP組比較，硫酸鎂組、丹參組HIF-1α、sFLT-1 mRNA及蛋白水平明顯下降，且丹參組低于硫酸鎂組。有研究證實(shí)，丹參川芎嗪與硫酸鎂對HDCP的治療兩者同樣具有降低大鼠血壓、尿蛋白的作用，改善HDCP造成的胎盤、胎兒發(fā)育異常，降低胎鼠死亡率低，但丹參川芎嗪為中藥成分，其安全性更高[18-19]。有學(xué)者認(rèn)為，VEGF水平下降是血管內(nèi)皮功能障礙及妊娠期血壓升高的重要原因，HIF-1α可與VEGF相關(guān)靶基因結(jié)合后血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，胎盤發(fā)育遲緩，影響新生兒的健康[20]。薛峰等[21]通過對妊娠高血壓孕產(chǎn)婦及健康孕產(chǎn)婦對比研究表明，妊娠高血壓孕產(chǎn)婦血清中sFLT-1、胎盤生長因子（PLGF）水平及sFLT-1/PLGF比值均高于健康孕產(chǎn)婦，提示sFLT-1、PLGF參與妊娠高血壓的發(fā)生及發(fā)展。相關(guān)研究證實(shí)，sFLT-1在血管中新分支生成、重建中扮演重要角色，HIF-1α水平升高造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，參與胎盤組織的結(jié)構(gòu)改變，丹參川芎嗪降壓機(jī)制可能與其擴(kuò)張血管、抑制胎盤組織HIF-1α表達(dá)，同時具有利尿的功效有關(guān)[22]。

綜上所述，丹參川芎嗪與硫酸鎂均對HDCP大鼠有明顯治療作用，胎鼠妊娠結(jié)局較好，且丹參川芎嗪效果更佳，其作用機(jī)制可能與降低大鼠胎盤HIF-1α、sFLT-1表達(dá)有關(guān)。