陳罕，孫肖爽，李紅杰，韋紅偉，徐忠信

1 長春市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，長春130051；2 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3 長春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院

血管性認知損傷是目前發(fā)展中國家認知功能障礙的首要原因，但其確切的分子機制仍不清楚，而對細胞信號通路的研究一直是其中熱點。慢性腦缺血指各種原因引起的腦血流量長期、慢性供血不足而導(dǎo)致的腦代謝障礙和功能衰退，被認為是血管性癡呆、阿爾茨海默病的共同病理過程，可導(dǎo)致持久性進展性認知損傷，能夠較好的模擬血管性認知損傷的病理生理過程［1-2］。沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1（SIRT1）被發(fā)現(xiàn)可在腦缺氧、缺血相關(guān)疾病中通過多種機制減輕神經(jīng)損傷，并已成為多種疾病治療中的關(guān)鍵靶點［3］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ 共激活因子1（PGC-1α）是SIRT1 去乙?；闹苯影悬c，其表達增加可以保護神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細胞死亡，過度產(chǎn)生的活性氧可激活海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的PGC-1α 信號通路，并上調(diào)其直接底物超氧化物歧化酶（SOD）的表達［4-5］。有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以通過SIRT1/PGC-1α 信號通路介導(dǎo)的線粒體保護作用減少高糖刺激誘導(dǎo)的腎臟足細胞的氧化損傷［6］，也可通過線粒體能量調(diào)節(jié)改善糖尿病性心肌病的心臟損傷［7］。石麗娜［8］發(fā)現(xiàn)，在胎鼠海馬神經(jīng)元氧糖剝奪體外模型中，提高SIRT1/PGC-1α信號通路表達后SOD表達增加、丙二醛（MDA）表達下降，提示SIRT1/PGC-1α 信號通路可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激在血管性認知損傷中發(fā)揮作用。2020年1月—12月，本研究通過建立慢性腦缺血大鼠模型，探討SIRT1/PGC-1α 信號通路在血管性認知損傷中的作用，并分析該作用是否與氧化應(yīng)激有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 健康雄性2～3 月齡Wistar大鼠34 只，體質(zhì)量260～300 g，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SYXK（吉）2018-0001。主要試劑：SIRT1 激活劑白藜蘆醇購自上海金穗生物科技有限公司，SIRT1 去乙?；种苿〦X-527 購自美國Santa Cruz Biotechnology；兔抗鼠SIRT1 單克隆IgG抗體（#9475）購自美國Cell Signaling Technology；兔抗鼠PGC-1α多克隆IgG 抗體（sc-13067）購自美國Santa Cruz Biotechnology；羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗（ZB-2301）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物制品公司；SOD、MDA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Morris 水迷宮由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，側(cè)腦室微量給藥系統(tǒng)購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，SIRT1、PGC-1α、β-actin 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 動物分組與造模處理 將34 只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、激活組、聯(lián)合組各7只及抑制組6只。采用改良版雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎法［9］制備慢性腦缺血大鼠模型。使用10% 水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，對大鼠雙側(cè)頸總動脈遠端和近端進行雙重結(jié)扎，同時剪斷大鼠尾末端；假手術(shù)組僅分離暴露大鼠雙側(cè)頸總動脈而不結(jié)扎。激活組、聯(lián)合組將白藜蘆醇溶于25% 二甲基亞砜內(nèi)按25% 配制為10 mg/mL 溶液，以50 mg/（kg·d）連續(xù)腹腔注射；聯(lián)合組、抑制組將EX-527溶于25%二甲基亞砜按照1 μg/μL 經(jīng)微量注射器向腦室內(nèi)注射5 μL；假手術(shù)組及模型組大鼠均使用相同容積的25% 二甲基亞砜腹腔注射做對照；各組均連續(xù)給藥6周。

1.3 認知功能觀察 采用Morris 水迷宮試驗，包括定位航行試驗和空間探索試驗。定位航行試驗連續(xù)進行5 d，每日將各組大鼠面向池壁分別從4 個入水點放入水中若干次，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間，即逃避潛伏期。定位航行試驗全部完成后，于當日立即進行空間探索試驗。在去除水下平臺后，從平臺對側(cè)象限將大鼠放入水池中，記錄在原平臺所在象限停留的時間。逃避潛伏期時間越短、目標象限停留時間越長，表示大鼠認知功能越好。

1.4 海馬CA1區(qū)標本獲取及處理 對完成認知功能檢測后的大鼠進行迅速斷頭取腦后立即放在冰盤上，迅速取出海馬。海馬取材起點為大鼠腦底部下丘腦處，即白色的視交叉處，于解剖顯微鏡下去除多余組織及血管，切除兩末端，將剩余海馬等份切為三段，垂直放置，在大彎端沿錐體線一分為二，上端透明部分為CA1區(qū)。對海馬標本進行石蠟包埋，制作石蠟切片進行免疫組化檢測，對所有組織標本行從前向后冠狀切片，切片厚度均為4 μm。

1.5 SIRT1、PGC-1α蛋白表達檢測

1.5.1 免疫組化 利用SP 法進行免疫組化染色。使用二甲苯對石蠟切片進行脫蠟處理后，將切片用3% H2O2孵育15 min 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用PBS 漂洗3 次，每次5 min。使用檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復(fù)，用5% 山羊血清處理10 min 以阻斷非特異性抗體的結(jié)合。切片滴加SIRT1、PGC-1α 一抗，以PBS 作為空白陰性對照，在濕盒中4 ℃過夜。用PBS 沖洗切片3 次，每次5 min，滴入辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育30 min。用PBS 沖洗切片3 次，每次5 min，將切片用鏈霉素親和素—過氧化物酶溶液37 ℃孵育30 min。用PBS 沖洗切片3次，每次5 min，向切片滴加DAB溶液顯色5～10 min。用自來水充分沖洗，進行蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，干燥，加蓋玻片，等待鏡檢。每張切片利用HPLAS-1000 高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)于200 及400 倍鏡下隨機選取5 個視野，計算每個視野下SIRT1 和PGC-1α 陽性細胞總數(shù)占所有細胞總數(shù)的百分比率，以5 個視野的平均值作為最終判定指標。

1.5.2 Western blotting 對大鼠進行迅速斷頭取腦，立即將標本放在冰盤上，迅速剝離海馬，立即投入-70 ℃液氮中保存提取海馬CA1區(qū)總蛋白。用0.2% 的TBS 稀釋SIRT1 一抗（1∶300），DAB 試劑盒顯色，凝膠成像及分析系統(tǒng)掃描，Quantity one v4.62定量分析。以目的蛋白與相應(yīng)β-actin 條帶凈光密度的比值表示各組蛋白表達水平。

1.6 SIRT1、PGC-1α mRNA 表達檢測 采用qRTPCR 法。取保存于-70 ℃液氮中的海馬CA1區(qū)腦組織，采用TRIzol 法提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板進行PCR擴增。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。SIRT1、PGC-1α 的退火溫度為58 ℃，β-actin 退火溫度為55 ℃。引物序列：SIRT1 上游引物5′-TGTGGTGAAGATCTATGGAGGC-3＇，下游引物5′-TGTACTTGCTGCAGACGTGGTA-3′；PGC-1α上游引物5′-TATGGAGTGACATAGAGTGTGCT-3′，下游引物5′-GTCGCTACACCACTTCAATCC-3′；βactin 上游引物5′-CCAAGGCCAACCGCGAGAA?GATGAC-3′，下 游引 物5′-AGGGTACATGGTGGT?GCCGCCAGAC-3′。以β-actin 為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt計算SIRT1、PGC-1α mRNA相對表達量。

1.7 氧化應(yīng)激指標SOD、MDA 水平檢測 采用ELISA 法。取10% 的海馬CA1區(qū)腦組織勻漿，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，按SOD、MDA 試劑盒說明書進行操作。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以± s 表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組認知功能比較 與假手術(shù)組比較，模型組逃避潛伏期增長、目標象限停留時間減少。與模型組比較，激活組逃避潛伏期減少、目標象限停留時間增長，抑制組、聯(lián)合組逃避潛伏期增長、目標象限停留時間減少（P均<0.01）。見表1。

表1 各組認知功能比較（s，±s）

表1 各組認知功能比較（s，±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

組別假手術(shù)組模型組激活組抑制組聯(lián)合組n 7 7 7 6 7逃避潛伏期第1天47.09 ± 2.18 50.76 ± 2.12 49.00 ± 2.80 50.87 ± 2.52 51.20 ± 3.48第2天22.97 ± 2.28 35.05 ± 2.73*27.64 ± 2.54#38.76 ± 3.78 39.85 ± 2.75#第3天16.51 ± 2.12 28.47 ± 3.33*23.33 ± 1.99#34.26 ± 2.29#33.62 ± 3.16#第4天12.14 ± 2.24 15.55 ± 2.34 13.22 ± 1.47 19.20 ± 2.04#21.21 ± 2.46#第5天11.89 ± 1.82 23.64 ± 3.66*16.88 ± 2.02#26.37 ± 2.00 28.23 ± 2.97#目標象限停留時間51.44 ± 2.37 32.07 ± 2.17*38.85 ± 1.93#27.21 ± 1.86#28.86 ± 1.80#

2.2 各組SIRT1、PGC-1α 蛋白表達比較 與假手術(shù)組比較，模型組SIRT1、PGC-1α 蛋白表達減少。與模型組比較，激活組SIRT1、PGC-1α 蛋白表達增加；抑制組PGC-1α 蛋白表達減少；聯(lián)合組SIRT1 蛋白表達增加、PGC-1α 蛋白表達減少（P均<0.05）；抑制組SIRT1蛋白表達與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 各組SIRT1、PGC-1α蛋白表達比較（±s）

表2 各組SIRT1、PGC-1α蛋白表達比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別假手術(shù)組模型組激活組抑制組聯(lián)合組n 7 7 7 6 7 SIRT1免疫組化0.39 ± 0.06 0.13 ± 0.05*0.22 ± 0.04#0.10 ± 0.05 0.22 ± 0.02#Western blotting 1.33 ± 0.05 0.82 ± 0.03*1.10 ± 0.06#0.74 ± 0.06 1.11 ± 0.05#PGC-1α免疫組化0.87 ± 0.04 0.58 ± 0.03*0.72 ± 0.07#0.46 ± 0.04#0.45 ± 0.04#Western blotting 1.68 ± 0.11 0.99 ± 0.10*1.39 ± 0.09#0.46 ± 0.08#0.55 ± 0.05#

2.3 各組SIRT1、PGC-1α mRNA 表達比較 各組SIRT1、PGC-1α mRNA 表達比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 各組SIRT1、PGC-1α mRNA表達比較（±s）

表3 各組SIRT1、PGC-1α mRNA表達比較（±s）

注：各組間比較，P>0.05。

組別假手術(shù)組模型組激活組聯(lián)合組抑制組n 7 7 7 7 6 SIRT1 1.07 ± 0.14 1.02 ± 0.12 1.04 ± 0.11 1.07 ± 0.13 1.06 ± 0.14 PGC-1α 0.98 ± 0.10 0.96 ± 0.09 0.94 ± 0.10 0.95 ± 0.09 1.01 ± 0.71

2.4 各組氧化應(yīng)激指標SOD、MDA 水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組SOD 水平降低、MDA 水平升高。與模型組比較，激活組SOD 水平升高、MDA 水平降低，抑制組SOD 水平降低、MDA 水平升高，聯(lián)合組MDA 水平升高（P均<0.05）；聯(lián)合組SOD 水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表4 各組氧化應(yīng)激指標SOD、MDA水平比較（±s）

表4 各組氧化應(yīng)激指標SOD、MDA水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別假手術(shù)組模型組激活組抑制組聯(lián)合組n 7 7 7 6 7 SOD 98.15 ± 4.43 81.98 ± 5.79*91.71 ± 4.78#69.24 ± 2.83#78.19 ± 5.30 MDA 10.60 ± 2.61 18.11 ± 4.21*11.35 ± 2.35#35.26 ± 7.03#27.43 ± 2.63#

3 討論

目前認為，血管性癡呆是惟一可以防治的癡呆，但其發(fā)病機制仍不完全清楚［10］。一些已經(jīng)應(yīng)用于臨床的治療藥物對于血管性癡呆的臨床癥狀改善效果不盡人意，這種情況也一直引導(dǎo)和激勵著眾多研究者對其展開更廣泛深入的研究。慢性腦缺血能夠?qū)е掠谰眯匝苄哉J知損傷，但目前慢性腦缺血與血管性認知損傷中精確的分子機制尚未完全確定，對此進行進一步研究可能為血管性癡呆的治療提供新的干預(yù)手段。

慢性腦缺血引起的認知損傷病理生理機制復(fù)雜，而氧化應(yīng)激可被認為是其中關(guān)鍵因素，并可作為治療血管性認知損傷的潛在靶點［11-12］。慢性腦缺血能夠產(chǎn)生一種嚴重的永久性缺血、缺氧狀態(tài)，而這種狀態(tài)同時足以維持持續(xù)的氧化應(yīng)激，該機制可能是導(dǎo)致持續(xù)和進行性神經(jīng)元損傷的原因。本研究結(jié)果顯示，慢性腦缺血時大鼠海馬CA1區(qū)氧化應(yīng)激指標SOD 水平下降、MDA 水平升高，提示腦內(nèi)抗氧化系統(tǒng)能力下降，氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，氧化應(yīng)激可能參與了認知損傷的發(fā)生發(fā)展。SIRT1 已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以在多種疾病狀態(tài)下調(diào)節(jié)細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)，并可調(diào)控包括PGC-1α 在內(nèi)的多個信號通路［13］。研究顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的SIRT1 可以調(diào)節(jié)病理條件下細胞氧化應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。SIRT1相關(guān)通路的活性可以通過其天然激活劑白藜蘆醇來增強，也可以通過SIRT1 去乙酰化抑制劑EX-527 來減弱［12］。我們的研究顯示，慢性腦缺血時使用白藜蘆醇和EX-527對SIRT1/PGC-1α信號通路活性進行調(diào)節(jié)，可伴隨著SOD、MDA 水平的改變，提示SIRT1/PGC-1α 信號通路與慢性腦缺血時大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)。

目前，關(guān)于SIRT1/PGC-1α 信號通路與癡呆的研究較少。王承展［14］發(fā)現(xiàn)，SIRT1/PGC-1α信號通路在阿爾茨海默病模型中可以發(fā)揮認知改善作用。周羅可等［15］發(fā)現(xiàn)，SIRT1/PGC-1α信號通路可以減輕血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元凋亡。我們的研究顯示，SIRT1/PGC-1α 信號通路通過氧化應(yīng)激參與了血管性認知損傷。 慢性腦缺血時，大鼠海馬CA1區(qū)SIRT1/PGC-1α 信號通路蛋白水平下降，提示腦缺血、缺氧后其活性受到抑制；通過白藜蘆醇上調(diào)SIRT1/PGC-1α 通路表達后，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力增強，伴隨SOD 水平上升和MDA 表達下降；EX-527 則可抑制SIRT1 對PGC-1α 蛋白增強表達作用，以及SOD 和MDA 水平的變化。以上結(jié)果進一步證實了慢性腦缺血時SIRT1/PGC-1α 信號通路活性受到抑制，而增強其活性可通過對抗腦內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)改善大鼠的血管性認知損傷。本研究qRT-PCR 結(jié)果顯示，SIRT1 和PGC-1α 的mRNA 水平各組間比較差異不明顯，提示慢性腦缺血后，SIRT1/PGC-1α 通路活性受到抑制主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，這與SCHIRMER 等［16］在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。而SHI 等［17］報道在氧糖剝奪所致氧化應(yīng)激體外模型的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元內(nèi)，SIRT1 和PGC-1α 的mRNA和蛋白表達水平均受到抑制，推測與本實驗結(jié)果存在差異的原因可能是SHI 等的實驗?zāi)Ｐ捅举|(zhì)上是急性缺血缺氧狀態(tài)下的體外細胞應(yīng)激模型，而我們的實驗則是慢性缺血的體內(nèi)模型，可能SIRT1 和PGC-1α 的轉(zhuǎn)錄水平受到了其他因素的調(diào)節(jié)和代償。

綜上所述，SIRT1/PGC-1α 信號通路在慢性腦缺血時活性受到抑制，使用白藜蘆醇上調(diào)SIRT1/PGC-1α 信號通路表達后可以改善大鼠的血管性認知損傷，這可能與腦內(nèi)增強的抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)。