曾裕文，吳帆，，譚國鉗，張芳雍

1 暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院肝膽外科，廣州510220；2 廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院肝膽外科

肝癌是我國高發(fā)的、危害極大的惡性腫瘤，其近年來的發(fā)病率持續(xù)上升［1］。肝癌的高異質(zhì)性和放化療耐藥，以及早期診斷困難、疾病進(jìn)展迅速和缺乏高效的靶向藥物，導(dǎo)致其整體治療效果并不理想。因此，開發(fā)肝癌早期診斷、治療和預(yù)后的評估方法對提高肝癌患者的生存率具有重要意義。研究表明，脂質(zhì)代謝失調(diào)是癌癥中最顯著的代謝改變之一，不僅影響原發(fā)性腫瘤的生長，而且介導(dǎo)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［2］。JIANG 等［3］通過組織微陣列芯片分析顯示，膽固醇酯在254 例肝癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織，提示脂質(zhì)代謝可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。但迄今為止，脂質(zhì)代謝在肝癌中的作用尚不明確。2021年1 月—5 月，本研究通過生物信息學(xué)分析，篩選在肝癌中可能發(fā)揮重要作用的脂代謝基因，構(gòu)建肝癌患者預(yù)后預(yù)測模型，并通過該模型分析脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)與肝癌預(yù)后的相關(guān)性，以期探索脂代謝基因在肝癌診治中的潛在價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)和患者臨床資料收集 從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov）和國際癌癥基因組聯(lián)合體數(shù)據(jù)庫（IC?GC，https：//daco.icgc.org/）下載截至2020年11 月收錄的肝癌患者腫瘤組織和正常肝組織的mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床資料（TCGA 庫數(shù)據(jù)以歐美人種為主、ICGC數(shù)據(jù)僅為亞洲人種）。TCGA數(shù)據(jù)庫共收集到374 個(gè)肝癌組織、50 個(gè)正常肝組織的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)，370 例肝癌患者的臨床資料，內(nèi)容包括性別、年齡、生存時(shí)間、生存狀態(tài)、組織學(xué)分級和TNM 分期。ICGC 數(shù)據(jù)庫共收集到240 個(gè)肝癌組織、202 個(gè)正常肝組織的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)，231 例肝癌患者的臨床資料，內(nèi)容包括患者的生存時(shí)間和生存狀態(tài)。

1.2 脂質(zhì)代謝基因獲取 從基因集合富集分析網(wǎng)站（GSEA，http：//www.gsea- msigdb.org/gsea/msig?db/index.jsp）下載與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因集，包括脂蛋白代謝（GO_LIPOPROTEIN_METABOL?IC_PROCESS）、脂蛋白生物合成（GO_LIPOPRO?TEIN_BIOSYNTHETIC_PROCESS） 、膜脂代謝（GO_MEMBRANE_LIPID_METABOLIC_PROESS）、磷脂生物合成（GO_PHOSPHOLIPID_BIOSYNTHET?IC_PROCESS）、磷脂代謝（GO_PHOSPHOLIP?ID_METABOLIC_PROCESS）、甘油脂質(zhì)代謝（GOBP_GLYCEROLIPID_METABOLIC_PROCESS）6個(gè)脂代謝相關(guān)信號通路，以TCGA 數(shù)據(jù)庫下載的374個(gè)肝癌組織、50 個(gè)正常肝組織的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)為輸入文件，通過GSEA 軟件（4.0.1 版本）對所選6 個(gè)信號通路進(jìn)行基因富集分析。

1.3 肝癌組織中差異表達(dá)脂質(zhì)代謝基因篩選 采用perl 軟件（5.26.3 版）提取6 個(gè)脂代謝相關(guān)信號通路中的基因，然后通過R 軟件（4.0.2 版）對所提取的基因按照P<0.01，logFC>1.5 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過濾，篩選出在肝癌組織中差異表達(dá)的脂質(zhì)代謝基因。

1.4 肝癌預(yù)后相關(guān)關(guān)鍵脂代謝基因篩選 通過R軟件的limma 包將所有表達(dá)上調(diào)脂代謝基因的表達(dá)數(shù)據(jù)與生存數(shù)據(jù)合并，引用survival 包進(jìn)行單因素Cox 分析，分別計(jì)算表達(dá)上調(diào)脂代謝基因的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）和P，按照P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過濾。將篩選得到的基因納入多因素Cox 回歸分析，篩選能獨(dú)立影響肝癌預(yù)后的關(guān)鍵脂代謝基因。

1.5 基于脂代謝相關(guān)基因的肝癌預(yù)后預(yù)測模型建立 基于關(guān)鍵脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)構(gòu)建肝癌患者預(yù)后預(yù)測模型，模型公式：風(fēng)險(xiǎn)評分=基因1的表達(dá)量×基因1的β1系數(shù)+基因2的表達(dá)量×基因2的β 2系數(shù)+……+基因n 的表達(dá)值×基因n 的βn 系數(shù)，其中β 系數(shù)由R 軟件在多因素Cox 回歸分析時(shí)直接得出。

1.6 基于脂代謝相關(guān)基因的肝癌預(yù)后預(yù)測模型評價(jià)

1.6.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫 按照公式計(jì)算TCGA 數(shù)據(jù)庫中370 例肝癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評分，取其中位數(shù)作為截?cái)嘀?，將肝癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。先利用R 軟件“survival”和“survminer”包對兩組進(jìn)行Ka?plan-Meier 生存分析并繪制生存曲線，利用R 軟件“survivalROC”包繪制受試者工作特征（ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（AUC）。根據(jù)患者的年齡、性別、TNM分期和風(fēng)險(xiǎn)評分，利用R軟件“rms”包構(gòu)建諾莫列線圖并計(jì)算C值。將患者的年齡、性別、組織學(xué)分級、TNM 分期和風(fēng)險(xiǎn)評分分別納入單因素和多因素Cox回歸分析并計(jì)算各因素的P和HR。

1.6.2 ICGC 數(shù)據(jù)庫 使用ICGC 數(shù)據(jù)庫中下載的肝癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過R軟件的“l(fā)imma”包將基因的表達(dá)數(shù)據(jù)與生存數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，按照風(fēng)險(xiǎn)評分計(jì)算公式計(jì)算出每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)評分，取其中位數(shù)作為截?cái)嘀?，將肝癌患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。利用R軟件“survival”和“survminer”包對兩組患者進(jìn)行Kaplan-Meier 生存分析并繪制生存曲線，利用R 軟件“sur?vivalROC”包繪制ROC曲線，計(jì)算AUC。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中差異表達(dá)脂質(zhì)代謝基因篩選結(jié)果 6 個(gè)脂代謝信號通路基因集基因富集分析結(jié)果顯示，6 個(gè)基因集在肝癌組織中表達(dá)均上調(diào)，P<0.01。見表1。因?yàn)? 個(gè)基因集均在肝癌組織中富集，故只選擇表達(dá)上調(diào)的基因作為肝癌預(yù)后相關(guān)脂代謝基因。利用perl 軟件提取6 個(gè)基因集中的不同基因共757 個(gè)，按照P<0.01、logFC>1.5標(biāo)準(zhǔn)過濾后，篩選出在肝癌組織表達(dá)上調(diào)的基因109 個(gè)。

表1 基因集在肝癌中的富集結(jié)果

2.2 肝癌預(yù)后相關(guān)關(guān)鍵脂代謝基因篩選結(jié)果 單因素Cox回歸分析顯示，共有21個(gè)P<0.05的肝癌預(yù)后相關(guān)脂代謝基因。將21個(gè)基因納入多因素Cox回歸分析，篩選出6 個(gè)能獨(dú)立影響肝癌預(yù)后的關(guān)鍵脂代謝基因，分別為DAGLA、PCSK9、PIGU、FABP6、GLA、ESYT3。

2.3 基于脂代謝相關(guān)基因的肝癌預(yù)后預(yù)測模型構(gòu)建結(jié)果 根據(jù)6 個(gè)關(guān)鍵脂代謝基因的mRNA 表達(dá)水平和β系數(shù)計(jì)算每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評分。預(yù)后預(yù)測模型為：風(fēng)險(xiǎn)評分=DAGLA×0.161 878 597 + PCSK9×0.014 967 28 + PIGU×0.043 461 843 + FABP6×0.078 505 362 + GLA×0.019 799 065 + ESYT3×0.278 063 77。

2.4 基于脂代謝相關(guān)基因的肝癌預(yù)后預(yù)測模型評價(jià)結(jié)果

2.4.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫 根據(jù)預(yù)后預(yù)測模型計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評分，取風(fēng)險(xiǎn)評分中位數(shù)（0.85）為截?cái)嘀?，將TC?GA 數(shù)據(jù)庫中的370 例肝癌患者分為低風(fēng)險(xiǎn)者（185例）、高風(fēng)險(xiǎn)者（185 例）。Kaplan-Meier 生存分析顯示，高風(fēng)險(xiǎn)者的生存時(shí)間為（1.79 ± 1.95）年，低風(fēng)險(xiǎn)者的生存時(shí)間為（2.46 ± 1.95）年，高風(fēng)險(xiǎn)者的生存時(shí)間低于低風(fēng)險(xiǎn)者（P<0.01）。ROC 曲線分析顯示，預(yù)測肝癌患者生存率的AUC 為0.732。利用R軟件構(gòu)建諾莫列線圖，見圖1。評價(jià)得到C 值為0.706，提示該模型對肝癌患者生存率的預(yù)測能力良好。單因素和多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評分及TNM 分期是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子（P均<0.01），而年齡、性別和組織學(xué)分級對患者的預(yù)后無明顯影響（P均>0.05）。

圖1 基于脂代謝相關(guān)基因的肝癌預(yù)后預(yù)測模型諾莫列線圖

2.4.2 基于ICGC 數(shù)據(jù)庫的預(yù)后預(yù)測模型評價(jià)結(jié)果 取風(fēng)險(xiǎn)評分中位數(shù)（15.21）為截?cái)嘀担瑢CGC數(shù)據(jù)庫中的231 例肝癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)者（115 例）和低風(fēng)險(xiǎn)者（116 例），Kaplan-Meier 生存分析顯示，高風(fēng)險(xiǎn)者的生存時(shí)間為（2.05 ± 1.22）年，低風(fēng)險(xiǎn)者的生存時(shí)間為（2.39 ± 1.04）年，高風(fēng)險(xiǎn)者的生存時(shí)間低于低風(fēng)險(xiǎn)者（P<0.01）。ROC 曲線分析顯示，預(yù)測肝癌患者生存率的AUC為0.693。

3 討論

脂質(zhì)代謝異常是近年來腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)脂類從頭合成的增加是人類癌癥的共同特征［4］。例如，脂肪酸合成酶及催化脂肪酸合成的關(guān)鍵酶在人類惡性腫瘤中存在過表達(dá)，水解單酰甘油釋放游離脂肪酸的脂解酶在侵襲性腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，而通過抑制脂肪酸合成酶可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞系的增殖活性［5］。研究顯示，與非惡性腫瘤性肝組織相比，參與脂肪酸生物合成的基因在大多數(shù)肝癌組織中普遍上調(diào)，但脂質(zhì)代謝及其相關(guān)基因與肝癌預(yù)后的關(guān)系尚不清楚［6］。

為此，本研究通過GSEA 數(shù)據(jù)庫下載與脂質(zhì)代謝相關(guān)的信號通路，每個(gè)信號通路含有數(shù)十至數(shù)百個(gè)不等的基因，最后整理出所有信號通路中的不同基因共757個(gè)，以此作為脂質(zhì)代謝相關(guān)基因。從TC?GA 數(shù)據(jù)庫下載肝癌患者的mRNA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床資料，利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選出在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)的脂代謝相關(guān)基因共109 個(gè)。為探究這些差異基因的表達(dá)水平與肝癌預(yù)后的關(guān)系，先利用R軟件中的survival 包進(jìn)行單因素Cox 分析，初步篩選出21 個(gè)與肝癌預(yù)后相關(guān)的脂代謝基因。考慮到單因素Cox 回歸分析每一次只納入一個(gè)變量，可能存在過度擬合的現(xiàn)象，因此對單因素Cox 回歸篩選出的21 個(gè)基因進(jìn)行多因素Cox 回歸分析，最終篩選得到了6 個(gè)與肝癌預(yù)后密切相關(guān)的脂代謝基因，分別為DAGLA、PCSK9、PIGU、FABP6、GLA、ESYT3，本研究即以這6 個(gè)基因作為模型構(gòu)建基因構(gòu)建了肝癌預(yù)后預(yù)測模型。

為評估該模型的預(yù)測價(jià)值及可靠性，本研究通過肝癌預(yù)后預(yù)測模型公式計(jì)算出TCGA 數(shù)據(jù)庫中370 例肝癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評分，并根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分的中位數(shù)將肝癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)者和低風(fēng)險(xiǎn)者。生存分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組的預(yù)后劣于低風(fēng)險(xiǎn)組；ROC曲線顯示，預(yù)測肝癌患者生存率的AUC 大于0.7，說明該模型對肝癌預(yù)后具有較好的預(yù)測能力［7］。本研究根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分和肝癌患者臨床信息構(gòu)建的諾莫列線圖可以判斷該模型的取分能力，根據(jù)諾莫列線圖得出的C 值越接近1，說明列線圖的預(yù)測能力越準(zhǔn)確。我們構(gòu)建的預(yù)測模型C值為0.706，表示該模型具有較好的區(qū)分能力［8］。本研究還將風(fēng)險(xiǎn)評分和肝癌臨床病理特征一起進(jìn)行單因素和多因素Cox 回歸分析，結(jié)果顯示風(fēng)險(xiǎn)評分和TNM 分期同為影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子。上述結(jié)果提示，本研究模型的風(fēng)險(xiǎn)評分與肝癌預(yù)后密切相關(guān)且可較好的預(yù)測肝癌患者預(yù)后?？紤]到TCGA 數(shù)據(jù)庫中主要為歐美人種數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的預(yù)測價(jià)值，本研究通過ICGC 數(shù)據(jù)庫下載了亞洲人種的肝癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，通過肝癌預(yù)后預(yù)測模型公式計(jì)算出ICGC 數(shù)據(jù)庫中231 例肝癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評分，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)者的生存時(shí)間低于低風(fēng)險(xiǎn)者，預(yù)測肝癌患者生存率AUC 為0.662，該結(jié)果TCGA 數(shù)據(jù)庫的結(jié)果基本一致。

在構(gòu)成本模型的6 個(gè)脂代謝基因中，PCSK9 和PIGU 已被證明可促進(jìn)肝癌的發(fā)展，PCSK9通過抑制肝癌細(xì)胞的凋亡來促進(jìn)腫瘤生長，是肝癌患者預(yù)后不良的指標(biāo)［9］；PIGU 可通過激活NF-κB 途徑和增加免疫逃逸來促進(jìn)肝癌的進(jìn)展［10］。DAGLA 和FABP6在其他腫瘤中有被報(bào)道，是致癌基因。DAGLA 可催化二酰甘油水解為2-花生四烯酰甘油和游離脂肪酸，通過促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程影響口腔癌的發(fā)生和發(fā)展［11］。OHMACHI等［12］通過對78例結(jié)直腸癌的腫瘤與癌旁組織進(jìn)行免疫組化發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP6 在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，且與腫瘤細(xì)胞的增值和侵襲密切相關(guān)。GLA 和ESYT3 在腫瘤中少有報(bào)道，但均有研究發(fā)現(xiàn)其與脂質(zhì)代謝有關(guān)，比如ESYT3在脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中起著重要作用，敲減ESYT3 可改善血脂代謝異常［13］。盡管其中一些基因在肝癌中的作用尚未有研究報(bào)道，但本研究顯示它們均在肝癌中過表達(dá)且能影響肝癌患者預(yù)后，提示這些基因在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，有必要進(jìn)一步研究其在肝癌中的具體功能及分子機(jī)制。腫瘤可通過多種機(jī)制逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，其中一種機(jī)制即涉及腫瘤脂質(zhì)庫的改變以及脂質(zhì)和脂肪酸的積累［14］。LUO 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中的脂質(zhì)含量明顯高于無腫瘤小鼠的巨噬細(xì)胞，且較高的脂質(zhì)含量降低了巨噬細(xì)胞的吞噬能力。本研究中的6個(gè)基因均在脂質(zhì)代謝信號通路中高表達(dá)且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，提示肝癌細(xì)胞可能通過上調(diào)這些基因的表達(dá)改變其自身的脂代謝過程，從而降低其周圍環(huán)境中免疫細(xì)胞的抗腫瘤能力并得以逃避免疫監(jiān)視。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析手段，篩選出6 個(gè)肝癌預(yù)后相關(guān)關(guān)鍵脂代謝基因，分別為DAGLA、PCSK9、PIGU、FABP6、GLA 及ESYT3。以這6個(gè)基因作為模型構(gòu)建的肝癌預(yù)后預(yù)測模型對肝癌患者的預(yù)后有較好的預(yù)測價(jià)值及可靠性，提示脂代謝基因可能是潛在的肝癌標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。