許耿，仲逢鈺，顧海濤

1 南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院小兒心胸外科，南京210009；2 南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒童保健科

先天性心臟?。–HD）是由心血管異常發(fā)育引起的先天性疾病，發(fā)病率約為0.8%，是嬰兒因出生缺陷死亡的主要原因［1］。心肌分化與增殖是心臟發(fā)育的必要過程，該過程的異常往往導致心臟發(fā)育畸形。微小RNA（miRNA）是非編碼的單鏈小RNA 分子，可在許多細胞和生理過程中發(fā)揮調節(jié)作用，包括細胞生長、增殖、分化、凋亡以及組織和器官的形成［2］。研究顯示，miRNA 在調節(jié)胚胎心臟發(fā)育、心臟形態(tài)發(fā)生以及心肌細胞生長和分化方面發(fā)揮重要作用，同時與CHD 及心血管疾病的發(fā)生密切相關［3］。既往研究顯示，miR-93 在CHD 中差異表達顯著，然而其是否參與細胞增殖、心肌分化及其相關下游基因的表達調控目前均尚不明了［4］?；罨疶 細胞核轉錄因子3（NFATC3）是NFAT 家族的一員，在免疫細胞以外的多種細胞中表達，并在胚胎發(fā)育期間發(fā)揮關鍵作用，參與包括炎癥反應、心臟瓣膜形成、心肌發(fā)育和其他生物過程［5］。P19 細胞是小鼠的睪丸畸胎瘤細胞，可以分化成心肌細胞，被普遍應用于研究心臟發(fā)育［6］。2020年9 月—2021年6 月，我們利用P19 細胞作為心肌分化的細胞模型，探討了miR-93對P19 細胞增殖及心肌分化的影響，并對miR-93 及其潛在下游基因NFATC3的靶向調控關系進行了分析，以期為CHD治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞及試劑：P19 細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，逆轉錄試劑盒、定量PCR 試劑盒、SYBR Green Master Mix 購自日本TaKaRa 公司；α-MEM 培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、PBS緩沖液、青霉素/鏈霉素（P/S）、CCK-8溶液購自美國Gibco公司；miR-93過表達（miR-93 mimic）、NFATC3 過表達（NFATC3 mimic）質粒及陰性對照空白（NC）質粒由上海吉瑪基因提供，引物均由深圳瑞真公司設計提供；心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、鋅指轉錄因子GATA 結合蛋白4（GATA4）、NFATC3 及內參GAPDH 兔抗人一抗購自武漢三鷹公司，羊抗兔IgG 抗體購自英國Abcam公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司；TRIzol 試劑購自美國Thermo 公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma 公司，0.25% 胰蛋白酶購自美國Servicebio 公司。實驗儀器：實時熒光PCR 儀購自美國UVP 公司，多功能酶標儀購自美國Thermo 公司，紫外分光光度計購自上海美譜達儀器有限公司，Lipofectamine 3000 購自美國Thermo 公司。

1.2 miR-93對P19細胞增殖及心肌分化影響觀察

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組轉染 將P19 細胞置于含10% 胎牛血清、1% 青霉素和鏈霉素的α-MEM 完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長狀態(tài)較好時，用胰酶消化成單細胞懸浮液，將細胞懸液接種到培養(yǎng)皿中進行懸浮培養(yǎng)。將P19細胞分為三組，miR-93 組、NC 組分別采用Lipo?fectamineTM3000 轉染miR-93 mimic 及NC 質粒，對照組不轉染。

1.2.2 轉染效率檢測 采用RT-qPCR 法。轉染48 h 后收集各組細胞，加入TRIzol 裂解細胞，再加入氯仿、乙醇等離心后提取總RNA，使用TaKaRa 反轉錄試劑盒按照說明書將RNA 逆轉錄為cDNA，采用SYBR Green Master Mix 在Real-time PCR 儀中進行PCR 擴增。miR-93 上游引物5′-AGGTGCTGAGGA?GATCGTCG-3′、下游引物5′-TGAGGTGCTGTGCGT?GAC-3′，內參GAPDH 上游引物5′-CAGGGCT?GCTTTTAACTCTGGTAA-3′、下游引物5′- GGGTG?GAATCATATTGGAACATGT-3′。 PCR 反應條件：95 ℃10 min，94 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s，共循環(huán)40 次。采用2－ΔΔCt法計算miR-93相對表達量。結果顯示，對照組、NC 組、miR-93 組miR-93 相對表達量分別為1.00 ± 0.03、0.90 ± 0.04、14.18 ± 0.84，miR-93組miR-93相對表達量高于對照組及NC組（P<0.05），提示細胞轉染效率良好，可用于后續(xù)研究。

1.2.3 miR-93 對細胞增殖影響觀察 采用CCK-8法。收集轉染后的各組細胞，以2×103/孔接種于96 孔板中，每組設置5 個復孔，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。在0、24、48 h 取出細胞，更換培養(yǎng)基，各孔加入CCK-8 溶液10 μL，置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h。使用酶標儀在450 nm 處測量各組細胞的光密度（OD）值，OD 值越高表示細胞增殖能力越強。

1.2.4 miR-93 對細胞心肌分化影響觀察 收集轉染后的各組細胞，按照1×106/mL 接種于培養(yǎng)皿中，加入分化培養(yǎng)基（1% DMSO、10% 胎牛血清、1% 青/鏈霉素、α-MEM 培養(yǎng)基）誘導P19 細胞向心肌細胞分化，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 更換50% 的分化培養(yǎng)基。6 d 后，吸取30～40 個胚胎樣小體接種至6 孔板，改用不含DMSO 的α-MEM 完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每2 d換液一次，共分化10 d。采用Western blotting法檢測心肌分化標志基因cTnT、GATA4蛋白表達。收集分化10 d 的各組細胞，加入RIPA 裂解液，添加蛋白酶抑制劑PMSF，冰上裂解30 min。離心去除雜質，獲得細胞總蛋白。采用BCA 法檢測蛋白濃度，細胞總蛋白與上樣緩沖液混勻，將蛋白煮沸變性，每個泳道裝載20 μg 蛋白，SDS/PAGE 凝膠分離蛋白，并將蛋白轉移到PVDF 膜上，使用5% 脫脂牛奶封閉PVDF 膜。加入cTnT、GATA4 及GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗，常溫孵育2 h。使用超敏ECL 試劑盒檢測曝光蛋白條帶，Image J 軟件分析條帶灰度值。GAPDH 蛋白作為內參，以目的條帶與內參條帶灰度值的比值計算cTnT、GATA4蛋白相對表達量。

1.3 miR-93 靶向調控基因的篩選與驗證 在Tar?getScanhuman7.2 數據庫中搜索miR-93 的潛在靶基因，結果顯示NFATC3 mRNA 具有miR-93 的結合位點，見圖1。將P19 細胞以1×106/孔接種到12 孔板中，接種24 h 后分為四部分。以pmirGLO 為載體構建NFATC3 mut 與NFATC3 wt 質粒，與miR-93 mimic質粒、NC質粒采用LipofectamineTM3000進行共轉染，分別為NFATC3 wt+miR-93 mimic、NFATC3 wt+NC、NFATC3 mut+miR-93 mimic、NFATC3 mut+NC。 轉染48 h 后收集細胞，采用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

圖1 miR-93與NFATC3 mRNA結合位點示意圖

1.4 miR-93 對P19 細胞中NFATC3 表達影響觀察 采用Western blotting 法。收集轉染48 h 后的各組細胞，操作方法同“1.2.4”。以GAPDH 蛋白作為內參，以NFATC3 蛋白條帶與內參條帶灰度值的比值計算NFATC3蛋白相對表達量。

1.5 NFATC3 與miR-93 在P19 細胞增殖及心肌分化中的調控關系分析

1.5.1 細胞分組與轉染 取生長狀態(tài)良好的P19細胞另分為三組，miR-93 組、miR-93+NFATC3 組及NC組分別采用LipofectamineTM3000 轉染miR-93 mimic、miR-93 mimic+NFATC3 mimic及NC質粒48 h。

1.5.2 NFATC3 對miR-93 過表達所致細胞增殖及心肌分化影響觀察 取生長狀態(tài)良好的各組細胞，采用CCK-8 法觀察細胞增殖情況，方法同“1.2.3”；采用Western blotting 法檢測cTnT、GATA4 蛋白表達，方法同“1.2.4”。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料以±s 表示，兩組數據比較行獨立樣本t檢驗，多組數據比較行單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-93 對P19 細胞增殖的影響 miR-93 組除0 h 外，同時點細胞OD 值均低于NC 組和對照組（P均<0.05），NC 組與對照組同時點細胞OD 值比較差異均無統計學意義。見表1。

表1 miR-93對P19細胞增殖的影響（±s）

表1 miR-93對P19細胞增殖的影響（±s）

注：與對照組同時點比較，*P<0.05；與NC組同時點比較，#P<0.05。

組別miR-93組NC組對照組細胞OD值0 h 0.29 ± 0.01 0.28 ± 0.02 0.29 ± 0.01 24 h 0.48 ± 0.02*#0.80 ± 0.02 0.78 ± 0.03 48 h 1.01 ± 0.13*#1.54 ± 0.08 1.60 ± 0.11

2.2 miR-93 對P19 細胞心肌分化的影響 miR-93組心肌分化標志基因cTnT、GATA4 蛋白表達均低于NC 組和對照組（P均<0.05），NC 組與對照組cTnT、GATA4 蛋白表達比較差異均無統計學意義。見表2。

表2 各組心肌分化標志基因cTnT、GATA4蛋白表達比較（± s）

表2 各組心肌分化標志基因cTnT、GATA4蛋白表達比較（± s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與NC組比較，#P<0.05。

組別miR-93組NC組對照組cTnT 0.55 ± 0.02*#1.03 ± 0.06 1.00 ± 0.05 GATA4 0.42 ± 0.07*#0.95 ± 0.04 1.00 ± 0.04

2.3 miR-93 與NFATC3 雙熒光素酶基因報告檢測結果 轉染NFATC3 wt+NC 質粒、NFATC3 wt+miR-93 mimic 質粒的P19 細胞熒光素酶相對活性分別為1.00 ± 0.04、0.20 ± 0.02，二者比較P<0.01；轉染NFATC3 mut+NC 質粒、NFATC3 mut+miR-93 mimic質粒的P19 細胞熒光素酶相對活性分別為1.05 ±0.01、1.06 ± 0.03，二者比較P>0.05。

2.4 miR-93 對P19 細胞中NFATC3 表達的影響對照組、NC組與miR-93組NFATC3蛋白相對表達量分別為1.00 ± 0.16、1.03 ± 0.04、0.64 ± 0.11，miR-93 組NFATC3 蛋白表達低于對照組及NC 組（P均<0.05）。

2.5 NFATC3 對miR-93 過表達所致P19 細胞心肌分化及增殖的影響

2.5.1 NFATC3 對miR-93 過表達所致細胞增殖的影響 除0 h 外，同時點細胞OD 值NC 組>miR-93+NFATC3組>miR-93組（P均<0.05）。見表3。

表3 NFATC3對miR-93過表達所致細胞增殖的影響（±s）

表3 NFATC3對miR-93過表達所致細胞增殖的影響（±s）

注：與NC組同時點比較，*P<0.05；與MiR-93組同時點比較，#P<0.05。

組別miR-93+NFATC3組miR-93組NC組細胞OD值0 h 0.25 ± 0.01 0.25 ± 0.01 0.24 ± 0.01 24 h 0.59 ± 0.02#0.42 ± 0.03*0.72 ± 0.04 48 h 1.38 ± 0.09#0.96 ± 0.08*1.67 ± 0.14

2.5.2 NFATC3 對miR-93 過表達所致細胞心肌分化的影響 心肌分化標志基因cTnT、GATA4蛋白表達NC 組>miR-93+NFATC3 組>miR-93 組（P均<0.05）。見表4。

表4 各組cTnT、GATA4蛋白表達比較（±s）

表4 各組cTnT、GATA4蛋白表達比較（±s）

注：與NC組比較，*P<0.05；與MiR-93組比較，#P<0.05。

組別miR-93+NFATC3組miR-93組NC組cTnT 0.97 ± 0.09#0.70 ± 0.10*1.00 ± 0.12 GATA4 0.80 ± 0.12#0.45 ± 0.08*1.00 ± 0.06

3 討論

CHD 的發(fā)展是一個復雜的過程，受環(huán)境、遺傳等多種因素的影響，其確切病因尚不完全清楚［7］。近年來，研究人員利用RNA 測序技術鑒定了多種miRNA，這些miRNA 具有物種特異性和組織特異性，可用來作為疾病的生物標志物。此外，miRNA還被證明可以通過調節(jié)心臟組織增殖、再生和心室重構等生物過程來影響心血管疾病的發(fā)展［8］。既往研究發(fā)現，miR-93 與肺動脈高壓、心衰過程中的心室重塑等發(fā)生相關［9-10］。本研究利用P19 細胞作為心肌分化的細胞模型，發(fā)現miR-93 可抑制P19 細胞的增殖及心肌分化，該作用可能通過靶向NFATC3實現。

心肌細胞增殖和心肌分化在心血管發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，這些過程的相對平衡是心臟正常發(fā)育的前提。一旦平衡被打破，可能會導致心臟畸形［11］。近年來，幾種miRNA 被證實與心肌細胞增殖及心肌分化相關。miR-10-5p 可通過靶向TBX5 調節(jié)骨髓間充質干細胞向心肌細胞的分化，硒缺乏能夠通過靶向miR-215-5p/CTCF軸抑制雞的心肌發(fā)育和分化，miR-218 可通過正反饋回路調節(jié)增殖和分化影響小鼠心臟干細胞中的Wnt 信號傳導［12-14］。這些發(fā)現可能有助于理解CHD 的miRNAs/mRNAs 網絡，從而促進新基因療法的發(fā)展。本研究結果顯示，miR-93 過表達可抑制P19 細胞的增殖。在P19 細胞向心肌分化的過程中，胚胎小體的形成是心肌分化的關鍵步驟，而細胞增殖對胚胎小體的形成必不可少，因此miR-93 可能通過抑制細胞增殖來參與心肌分化。此外，通過誘導P19細胞的心肌分化，我們發(fā)現過表達miR-93 抑制了cTnT 和GATA4 的蛋白表達。GATA4 是心臟發(fā)育過程中重要的轉錄因子，是心臟譜系的早期標志物，并在心臟發(fā)育的整個過程中表達［15］；而cTnT 是心肌組織中的收縮蛋白基因及晚期心肌分化的特異性標志物［16］，這提示miR-93 可以抑制P19細胞的心肌分化。

miRNA 可以通過結合mRNA，阻止mRNA 參與調控相關的生物過程［3］。本研究通過雙熒光素酶報告實驗發(fā)現，miR-93 可以特異性結合NFATC3 基因并抑制NFATC3 蛋白表達，這提示NFATC3 可能是miR-93 的下游靶基因。研究發(fā)現，NFATC3 可以抑制miR-23a 的表達，促進M2 巨噬細胞極化，從而減輕心房的纖維化［17］。我們進一步觀察了NFATC3與miR-93 在P19 細胞中的調控關系，發(fā)現在P19 細胞中過表達NFATC3，可以特異性地逆轉miR-93 過表達對細胞增殖及心肌分化特異基因cTnT 和GATA4的抑制作用。 因此，我們推測miR-93 是通過與NFATC3 結合抑制NFATC3 的表達，從而抑制P19 細胞增殖和心肌分化。

綜上所述，miR-93 可抑制P19 細胞增殖及心肌分化，該作用可能是通過沉默NFATC3 的表達來實現的，miR-93 可能是CHD 的潛在治療靶點。但是，miR-93 的其他下游靶基因尚不明了，其相關作用機制有待進一步研究。