司麗君 王 雪 王林林 黃 華

新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊 830004

槲皮素（分子式：C15H10O7）是一種在植物中廣泛存在的黃酮類(lèi)化合物[1]，其具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、抗病毒[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]等多種藥理活性。槲皮素也是新疆一枝蒿[7]、濱蒿[8]、天山雪蓮[9]、金蓮花[10-11]、沙棘[12]、沙棗[13]等具有抗炎作用的新疆地產(chǎn)民族藥的成分之一。研究表明，槲皮素對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞釋放的一氧化氮、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6 和IL-1β 有顯著的抑制作用[14-16]，且槲皮素可以增強(qiáng)免疫低下小鼠的免疫力[17]，但其對(duì)活性氧（reactive oxygen species，ROS）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP1）和環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）的體外抑制作用，以及對(duì)正常小鼠免疫功能的影響少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)進(jìn)一步考察槲皮素對(duì)ROS、MCP1 和COX 的影響，并觀察槲皮素對(duì)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞、T 細(xì)胞和B 細(xì)胞增殖的影響，探討槲皮素的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，以期為槲皮素在炎癥及免疫疾病中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及動(dòng)物

RAW264.7 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；SPF 級(jí)BALB/C 雄性小鼠20 只，6～8 周齡，體重18～22 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，經(jīng)新疆藥物研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（XJIMM-2019004-1），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2018-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：65000700001086。

1.2 主要試劑與儀器

槲皮素（中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量為99.1%，批號(hào)：100081-201610）；LPS（Sigma，貨號(hào)：L2880）；伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，Con A）（Solarbio，貨號(hào)：C8110）；2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）（Sigma，貨號(hào)：D6883）；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒[Thermo Fisher，TNF-α 貨號(hào)：88-7324；IL-6 貨號(hào)：88-7064；γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）貨號(hào)：88-7314]，MCP1（武漢華美，貨號(hào)：CSB-E07430m）；COX 抑制劑篩選試劑盒（Cayman Chemical Company，貨號(hào)：700100）；微孔板檢測(cè)儀，美國(guó)美谷分子儀器（型號(hào)：SpectraMax M2）。

1.3 研究方法

1.3.1 RAW264.7 細(xì)胞采用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，以2×104個(gè)/孔接種在96 孔板中，采用不同濃度的槲皮素（125.00、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90、1.95、0.98、0 μg/ml）對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，每組4 個(gè)復(fù)孔。觀察其對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞活力的影響，采用MTS 法檢測(cè)細(xì)胞活力，選擇對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響的濃度的槲皮素以進(jìn)行下一步研究。

1.3.2 以無(wú)處理的RAW 264.7 細(xì)胞為空白組，采用1 μg/ml LPS 刺激RAW 264.7 細(xì)胞建立炎癥細(xì)胞模型[8]，將其分為模型組，槲皮素0.98、1.95、3.90、7.80 μg/ml劑量組，每組4 個(gè)復(fù)孔。采用MTS 法檢測(cè)細(xì)胞活力，DCFH-DA 法測(cè)定ROS 含量[8]，ELISA 檢測(cè)MCP1 水平。

1.3.3 按照COX 抑制劑篩選試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算抑制率：抑制率=（100%酶活性對(duì)照組-給藥組）/100%酶活性對(duì)照組×100%。以濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，非線性回歸求得IC50值。

1.3.4 將小鼠處死，參考文獻(xiàn)[18]制備細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml 的脾淋巴細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，每孔100 μl，采用不同濃度的槲皮素（7.80、3.90、1.95、0.98、0 μg/ml）對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖情況的影響。以無(wú)處理的小鼠脾淋巴細(xì)胞為對(duì)照組，將經(jīng)LPS（10 μg/ml）或Con A（8 μg/ml）處理的小鼠脾淋巴細(xì)胞分為L(zhǎng)SP 組、Con A 組，以及槲皮素0.98、1.95、3.90、7.80 μg/ml 劑量組，每組4 個(gè)復(fù)孔。采用MTS 法檢測(cè)不同濃度槲皮素對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞、Con A 誘導(dǎo)的T 細(xì)胞和LPS 誘導(dǎo)的B 細(xì)胞增殖情況，采用ELISA試劑盒檢測(cè)Con A 組及槲皮素各濃度組中TNF-α、IL-6、INF-γ 的水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Scheffe 法。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度槲皮素對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞活力的影響

槲皮素＜7.80 μg/ml 時(shí)RAW 264.7 細(xì)胞活力與未處理時(shí)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度槲皮素對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞活力的影響（n=4）

2.2 不同濃度槲皮素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞ROS 和MCP1 水平的影響

模型組ROS、MCP1 含量高于空白組，槲皮素0.98、1.95、3.90、7.80 μg/ml 劑量組ROS、MCP1 含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度槲皮素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞ROS 和MCP1 水平的影響（n=4）

2.3 槲皮素對(duì)COX-1、COX-2 抑制活性的影響

槲皮素對(duì)COX-1、COX-2 的IC50分別為12.73、0.44 μg/mL，COX-2 與COX-1 的IC550比值為0.034。

2.4 不同濃度槲皮素對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

槲皮素濃度為0.98、1.95、3.90、7.80 μg/ml 時(shí)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖均高于未處理時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度槲皮素對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響（n=4）

2.5 不同濃度槲皮素對(duì)小鼠T、B 細(xì)胞增殖及T 細(xì)胞中TNF-α、IL-6 和INF-γ 水平的影響

Con A 組T 細(xì)胞及LPS 組B 細(xì)胞均高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。槲皮素1.95、3.90、7.80 μg/ml 劑量組T 細(xì)胞低于Con A 組，槲皮素3.90、7.80 μg/ml 劑量組B 細(xì)胞低于LPS 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見(jiàn)圖4。Con A 組TNF-α、IL-6 和INF-γ水平均高于對(duì)照組，槲皮素1.95、3.90、7.80 μg/ml劑量組TNF-α 水平低于Con A 組，槲皮素各劑量組IL-6 和INF-γ 水平均低于Con A 組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），見(jiàn)圖5。

圖4 不同濃度槲皮素對(duì)小鼠T、B 細(xì)胞增殖的影響（n=4）

圖5 不同濃度槲皮素對(duì)小鼠T 細(xì)胞中TNF-α、IL-6 和INF-γ 水平的影響（n=4）

3 討論

LPS 刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 是評(píng)價(jià)藥物抗炎活性的經(jīng)典炎癥細(xì)胞模型。本研究通過(guò)RAW264.7炎癥模型發(fā)現(xiàn)，槲皮素可減少炎癥細(xì)胞ROS 和MCP1的釋放。ROS 具有細(xì)胞毒性，可引起DNA 損害、脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)、氨基酸氧化反應(yīng)破壞及細(xì)胞凋亡[19]。MCP1 可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)單核/巨噬細(xì)胞具有特異性趨化激活作用[20-21]。本研究結(jié)果顯示，槲皮素對(duì)炎癥細(xì)胞中ROS 和MCP1 的釋放均有很好的抑制作用。

花生四烯酸炎癥代謝網(wǎng)絡(luò)中的COX 是抗炎藥物的重點(diǎn)靶標(biāo)[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，藥物對(duì)COX-1 的抑制可引起不良反應(yīng)，而對(duì)COX-2 的抑制則產(chǎn)生抗炎作用，COX-2 選擇性抑制劑將使藥物的安全性大大提高。COX-2 抑制劑選擇性是通過(guò)體外試驗(yàn)測(cè)定COX-2與COX-l 的IC50比值來(lái)篩選的[24]，本研究結(jié)果顯示，槲皮素對(duì)COX-2 與COX-l 的IC50比值為0.034，提示槲皮素是COX-2 選擇性抑制劑。

本研究顯示槲皮素能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，又能抑制其T、B 細(xì)胞的增殖，抑制T 細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、INF-γ，這是否與槲皮素可以抑制抗CD3+和抗CD28+活化的初級(jí)人類(lèi)T 細(xì)胞的增殖及減少I(mǎi)L-2 的產(chǎn)生有關(guān)[25]，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，槲皮素具有選擇性抑制COX-2、巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用，還能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，抑制T、B 細(xì)胞的增殖。本研究有助于揭示槲皮素在調(diào)控炎癥及免疫疾病中的潛在應(yīng)用價(jià)值。槲皮素的炎癥保護(hù)作用及免疫調(diào)節(jié)的具體分子機(jī)制及靶點(diǎn)還有待于今后的進(jìn)一步深入研究。