趙亞如 劉 洋 呂 洋 王文華 王浩宇 王巧敏 王海萍

河北北方學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北張家口 075000

隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD）患病率逐漸升高，臨床一般采用藥物、介入或者搭橋等傳統(tǒng)治療，但這些方法只是緩解癥狀，心肌細(xì)胞（cardiac myocytes，CMs）如果在心肌缺血區(qū)域內(nèi)壞死，會(huì)形成纖維性瘢痕組織，從而發(fā)展為心力衰竭。通過(guò)臨床前研究表明，隨著骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC）移植，梗死面積總體減少了約7%，心功能改善了約11%[1]。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)加入化合物或者細(xì)胞因子、基因修飾、微環(huán)境的調(diào)節(jié)和物理因素刺激等都可以促進(jìn)BMMSC 向CMs 分化[2-4]。丁酸鈉通過(guò)抑制組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），使轉(zhuǎn)錄激活，從而促使BMMSC 向CMs 分化[5]，但低濃度的丁酸鈉抑制細(xì)胞增殖[6]，這限制丁酸鈉誘導(dǎo)分化的能力。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF-2）可以通過(guò)ERK 和JNK 途徑協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖再生[7-8]；丁酸鈉可以抑制HDAC 促進(jìn)FGF-2 生成[9-10]，因此為了提高其分化的效率，本研究選擇FGF-2 與丁酸鈉聯(lián)合誘導(dǎo)BMMSC 向CMs 分化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑

SPF 級(jí)2～3 周齡SD 大鼠（25±10）g 購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002，合格證號(hào)：No.1103241911030990]，實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循3R 原則。

流式細(xì)胞儀和鼠抗縫隙連接蛋白43（connexin 43，CX43）抗體（貨號(hào)：610061）購(gòu)自美國(guó)BD 公司；免疫細(xì)胞化學(xué)染色試劑盒（貨號(hào)：SP-9000）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）抗體（貨號(hào)：GTX109331）購(gòu)自美國(guó)Gene Tex 公司；兔抗Desmin 抗體（貨號(hào)：ET1606-30）購(gòu)自河北華安生物藥業(yè)有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 BMMSC 的分離和純化 2～3 周齡SD 大鼠，頸椎脫臼、醫(yī)用酒精消毒，依次取出四肢長(zhǎng)骨，用含有Pen-Strep 的PBS 沖洗骨髓腔，放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)48 h 后更換培養(yǎng)基，以后每隔72 h換1 次培養(yǎng)基，當(dāng)貼壁細(xì)胞融合至90%左右進(jìn)行傳代。

1.2.2 BMMSC 的鑒定 第3 代BMMSC 做流式，消化、吹打?yàn)榧?xì)胞懸液，均勻分裝到3 個(gè)離心管中，第1 個(gè)加適 量CD29-PE 抗 體、CD45-FITC 抗 體、CD90-PECyTM7 抗體，第2 個(gè)加入適量PE 抗體、FITC 抗體、PECyTM7 抗體，第3 個(gè)加入適量PBS，4℃避光孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 BMMSC 體外誘導(dǎo)分化 取第3 代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，分為4 組，對(duì)照組：加入普通完全培養(yǎng)基，丁酸鈉組：加入濃度為1 mmol/L 丁酸鈉培養(yǎng)基，F(xiàn)GF-2組：加入1 ng/ml FGF-2 的培養(yǎng)基，聯(lián)合組：加入含有濃度為1 mmol/L 丁酸鈉和1 ng/ml FGF-2 的培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h 后，全部換成普通完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 周。

1.2.4 定量反轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcriptase-mediated PCR,qRT-PCR）對(duì)心肌特異性基因的檢測(cè) 分別提取經(jīng)藥物誘導(dǎo)后1、2和4 周總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參，對(duì)目的基因GATA-4 進(jìn)行擴(kuò)增，GAPDH 正向引物20 bp：5’-ACTCTACCCACGGCAAGTTC-3’，反向引物20 bp：5’-TGGGTTTCCCGTTGATGACC-3’；GATA-4 正向引物20 bp：5’-TTTTATCCGCGAGCCTACGG-3’，反向引物20 bp：5’-AGGTACCGCTGTTGCTTGAA-3’，2-△△Ct相對(duì)定量分析數(shù)據(jù)，觀察目的基因的表達(dá)。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)心肌特異性蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)4 周后的細(xì)胞，消化、離心收集細(xì)胞，加入裂解液，在4℃冰箱50 min，測(cè)蛋白濃度；在蛋白樣品中添加適量的蛋白上樣緩沖液；把蛋白樣品加到各個(gè)上樣孔內(nèi)，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗（1∶1000）孵育膜，4℃、搖床過(guò)夜，二抗（1∶10 000）室溫孵育膜，ECL 化學(xué)發(fā)光、成像儀成像、最后圖像分析。

1.2.6 免疫組織化學(xué)測(cè)心肌特異性蛋白的表達(dá) 取誘導(dǎo)4 周后的細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)細(xì)胞，然后爬片，多聚甲醛固定，用0.5% TritonX-100 室溫透膜20 min；內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑室溫15 min；滴加山羊血清，37℃溫箱15 min；滴加一抗（1∶100）4℃過(guò)夜；復(fù)溫30 min 后加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫20 min；滴鏈酶卵白素－過(guò)氧化物酶，37℃15 min；滴加DAB，室溫顯色2 min；染核、分化、反藍(lán)、脫水、透明、樹(shù)脂封片，采集圖片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行資料分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析和單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

原代細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶中呈懸浮狀態(tài)，培養(yǎng)48 h后，首次換液細(xì)胞貼壁數(shù)量明顯增加并且開(kāi)始出現(xiàn)形態(tài)改變見(jiàn)圖1A（封三）；培養(yǎng)1 周的BMMSC 細(xì)胞進(jìn)一步伸展，出現(xiàn)梭形、多角形和不規(guī)則形等多種形態(tài)見(jiàn)圖1B（封三）；誘導(dǎo)培養(yǎng)4 周后的BMMSC，相鄰細(xì)胞間具有明顯的方向性排列，一些細(xì)胞甚至成了漩渦樣結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1C（封三）；聯(lián)合組誘導(dǎo)4 周后，相鄰細(xì)胞間排列的方向性，漩渦樣結(jié)構(gòu)與其他誘導(dǎo)組相比較更加明顯見(jiàn)圖1D（封三）。

圖1 BMMSC 的培養(yǎng)與誘導(dǎo)

2.2 表面抗原鑒定結(jié)果

用流式細(xì)胞儀測(cè)第3 周BMMSC 的表面抗原。最后測(cè)得表面抗原CD29、CD45、CD90 的陽(yáng)性表達(dá)率分別為93.3%、1.4%、95.1%。結(jié)果顯示全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)的細(xì)胞為純化的BMMSC。見(jiàn)圖2。

圖2 BMMSC 流式細(xì)胞術(shù)的鑒定

2.3 qRT-PCR 結(jié)果

整體分析：各組GATA-4 基因的表達(dá)、時(shí)間點(diǎn)及分組和時(shí)間交互作用比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。組內(nèi)比較：經(jīng)藥物誘導(dǎo)后的三組細(xì)胞誘導(dǎo)2 周GATA-4 基因的表達(dá)均高于誘導(dǎo)1、4 周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；誘導(dǎo)4 周基因的表達(dá)高于誘導(dǎo)1 周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。組間比較：經(jīng)藥物誘導(dǎo)后聯(lián)合組誘導(dǎo)2 周GATA-4 基因的表達(dá)高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；聯(lián)合組誘導(dǎo)1、4 周GATA-4 基因的表達(dá)與其他各組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 四組GATA-4 mRNA 表達(dá)水平比較（，n=3）

表1 四組GATA-4 mRNA 表達(dá)水平比較（，n=3）

注：與同組誘導(dǎo)1 周比較，aP ＜0.05；與同組誘導(dǎo)2 周比較，bP ＜0.05；與同期對(duì)照組比較，cP ＜0.05；與同期丁酸鈉組比較，dP ＜0.05；與同期FGF-2 組比較，eP ＜0.05。FGF-2：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2

2.4 Western blot 檢測(cè)結(jié)果

聯(lián)合組CX43、結(jié)蛋白（Desmin）和cTnI 蛋白的表達(dá)量均高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。丁酸鈉組和FGF-2 組CX43、Desmin 和cTnI 蛋白的表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；FGF-2 組cTnI 蛋白的表達(dá)量高于丁酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），兩組CX43、Desmin 蛋白的表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)圖3，表2。

表2 四組心肌特異性肌蛋白的表達(dá)水平比較（，n=3）

表2 四組心肌特異性肌蛋白的表達(dá)水平比較（，n=3）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與丁酸鈉組比較，bP ＜0.05；與FGF-2組比較，cP ＜0.05。CX43：縫隙連接蛋白43；Desmin：結(jié)蛋白；cTnI：心肌肌鈣蛋白I；FGF-2：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因2 子

圖3 Western blot 結(jié)果

2.5 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

BMMSC 誘導(dǎo)4 周后，聯(lián)合組心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）和cTnI 蛋白的表達(dá)量高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；FGF-2 組cTnT 和cTnI 蛋白的表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），F(xiàn)GF-2 組的cTnT 高于丁酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；丁酸鈉組cTnT 和cTnI 蛋白的表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 四組CTnT、CTnI 的陽(yáng)性率比較（%，，n=3）

表3 四組CTnT、CTnI 的陽(yáng)性率比較（%，，n=3）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與丁酸鈉組比較，bP ＜0.05；與FGF-2組比較，cP ＜0.05。cTnT：心肌肌鈣蛋白T；cTnI：心肌肌鈣蛋白I；FGF-2：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2

3 討論

近年來(lái)，將外源性干細(xì)胞移植入受損的心臟中，得到了廣泛研究和認(rèn)可[11-12]。干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。因間充質(zhì)干細(xì)胞較胚胎干細(xì)胞具有低的免疫原性、獲取相對(duì)容易、沒(méi)有道德問(wèn)題等特性，使它被廣泛研究用于心肌再生[13-14]。

丁酸鈉具有顯著的誘導(dǎo)分化的特點(diǎn)，它可以通過(guò)Wnt 通路誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)分化[15]；通過(guò)激活ERK 調(diào)控Runx2 基因的表達(dá)刺激干細(xì)胞分化成骨細(xì)胞[16]等。因GATA-4 和MEF-2c 為心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子[17]，丁酸鈉通過(guò)促進(jìn)GATA-4 和MEF-2c 心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子組蛋白乙?；蛊渑c目標(biāo)DNA 結(jié)合，從而促進(jìn)干細(xì)胞向CMs 的分化[18-19]。FGF-2 是刺激干細(xì)胞遷移、增殖和分化的強(qiáng)力有絲分裂原，F(xiàn)GF-2 不僅能促進(jìn)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，還可以重編程成纖維細(xì)胞為心肌樣細(xì)胞[20]。本研究運(yùn)用二者聯(lián)合和單獨(dú)誘導(dǎo)BMMSC 細(xì)胞3 d，比較他們之間的分化效率。

cTn 是心肌收縮的調(diào)節(jié)蛋白，由3 種亞基組成：cTnT、cTnI 和TnC，cTnI 和cTnT 是特定于心肌，用于心臟病實(shí)驗(yàn)室診斷[21-22]。CX43 主要存在于心臟內(nèi)，位于CMs 間隙連接處，以促進(jìn)動(dòng)作電位的傳播[23]。Desmin是中間絲的主要蛋白質(zhì)成分，在心臟中表達(dá)豐富[24]。BMMSC 經(jīng)藥物誘導(dǎo)4 周后，從蛋白水平和基因的表達(dá)水平表明，聯(lián)合組明顯高于其他組，這個(gè)結(jié)果可能是因?yàn)槎∷徕c的受體和FGF-2 的受體可以一起形成異源復(fù)合物，并觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)PI3K 和ERK 通路的表達(dá)[25]。

以上研究結(jié)果顯示，丁酸鈉和FGF-2 誘導(dǎo)BMMSC向心肌樣細(xì)胞分化，聯(lián)合比單獨(dú)誘導(dǎo)效果好，為臨床優(yōu)化治療IHD 的細(xì)胞療法提供理論支持。