余萍，張春宇，矯艷平，閔祥博，趙迪，李麗娜

（漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司，沈陽110000）

0 引言

益生菌是一類有益于宿主健康的活性微生物，具有改善宿主腸道的微生態(tài)平衡、增強(qiáng)免疫力及緩解乳糖不耐受等生理功能[1-3]。被廣泛應(yīng)用的益生菌有乳桿菌、腸球菌和雙歧桿菌等[4]。鼠李糖乳桿菌是近年來研究和應(yīng)用最為廣泛的益生菌，屬異型發(fā)酵的無芽孢短桿菌，在顯微鏡下觀察到的鼠李糖乳桿菌常以單鏈狀或成鏈狀存在，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、改善脂質(zhì)代謝等功能[5-9]。

乳酸菌培養(yǎng)基中除需碳源、氮源、維生素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素外，還需加入具有促生長作用的物質(zhì)，即促生長因子。為達(dá)到鼠李糖乳桿菌HCS01-003的增殖培養(yǎng)，本研究不僅優(yōu)化了培養(yǎng)條件，還篩選了優(yōu)化培養(yǎng)基中的促生長因子，包括低聚異麥芽糖、水蘇糖、低聚半乳糖及維生素B2、維生素B5、維生素B12。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

鼠李糖乳桿菌HCS01-003，篩選自6個(gè)月大順產(chǎn)健康嬰兒糞便，漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨8.0 g/L、葡萄糖25.0 g/L、酵母浸出物3.0 g/L、乙酸鈉6.0 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、吐溫80 0.5 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、余量為純化水，pH值6.20，按照配方比例稱量各組分、混合，加熱溶解，用1 mol/L食品級NaOH溶液調(diào)培養(yǎng)基pH值至6.20，115℃下滅菌30 min。

優(yōu)化培養(yǎng)基：蛋白胨14.0 g/L、葡萄糖30.0 g/L、酵母浸出物6.0 g/L、乙酸鈉3.0 g/L、硫酸鎂0.10 g/L、吐溫80 0.5 g/L、低聚異麥芽糖1 g/L、水蘇糖1.5 g/L、低聚半乳糖2 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、余量為無菌水，pH值6.80；按照配方比例稱量各組分，混合，加熱溶解，用1 mol/L食品級NaOH溶液調(diào)培養(yǎng)基pH值至6.80，115℃下滅菌30 min。

1.1.3 促生長因子

低聚異麥芽糖，保齡寶生物股份有限公司；低聚半乳糖，量子高科（中國）生物股份有限公司；水蘇糖，承德京天食品科技有限公司；維生素B2，湖北廣濟(jì)藥業(yè)股份有限公司；維生素B5，新發(fā)藥業(yè)有限公司；維生素B12，寧夏金維制藥股份有限公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-360/420電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；721型可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；三目系列生物顯微鏡，江西江鳳光學(xué)儀器有限公司；DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種保存

挑取單菌落，接種于5 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)20 h后，5%接種量轉(zhuǎn)接于100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)16 h。將菌懸液離心后取菌泥，以10∶1的比例加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基和甘油混合液（基礎(chǔ)培養(yǎng)基∶50%甘油=2∶3），分裝于凍存管中，-80℃冷凍保存。

1.2.2 菌株生長曲線的測定

將凍存管保存的菌種轉(zhuǎn)接到10 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)17 h，獲得菌懸液。以5%的接種量轉(zhuǎn)接50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)0～24 h，每小時(shí)取出一瓶測定菌懸液的OD值和pH值，繪制生長曲線。

1.2.3 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

（1）菌種復(fù)蘇。將凍存管放入37℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行菌種復(fù)蘇，15～30 s，至凍存管內(nèi)液體全部融化。

（2）一級培養(yǎng)。將凍存管內(nèi)的菌體轉(zhuǎn)接到10 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，一定溫度下培養(yǎng)16 h，獲得菌懸液。

（3）二級培養(yǎng)。將一級培養(yǎng)的菌懸液轉(zhuǎn)接到100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，上述相同溫度培養(yǎng)16 h，測定菌懸液的pH值、吸光度和收率，考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值、接種量和需氧型對菌體生長的影響。

（4）三級培養(yǎng)。在較優(yōu)的培養(yǎng)溫度、初始pH值和需氧型和接種量條件下，將二級培養(yǎng)的菌懸液接種到300 mL優(yōu)化培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)16 h，測定菌懸液的收率和活菌數(shù)，驗(yàn)證培養(yǎng)條件?？疾煲蛩厝绫?所示。

表1 培養(yǎng)條件因素水平

1.2.4 優(yōu)化培養(yǎng)基促生長因子的篩選

（1）單因素篩選。向優(yōu)化培養(yǎng)基中分別添加1.0 g/L的低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、水蘇糖、維生素B2、維生素B5、維生素B12，115℃滅菌30 min。采用相同的培養(yǎng)條件分別進(jìn)行三級發(fā)酵培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌，培養(yǎng)結(jié)束后，取菌懸液采用平板計(jì)數(shù)法檢測活菌數(shù)。

（2）促生長因子添加量篩選實(shí)驗(yàn)。將單因素實(shí)驗(yàn)篩選的活菌數(shù)較高的促生長因子分別以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的質(zhì)量濃度添加到優(yōu)化培養(yǎng)基中，115℃滅菌30 min。采用相同的培養(yǎng)條件分別進(jìn)行三級發(fā)酵培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌，培養(yǎng)結(jié)束后，取菌懸液采用平板計(jì)數(shù)法檢測活菌數(shù)，考察促生長因子添加量對菌體生長的影響。

（3）正交實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，將篩選出的促生長因子按照不同的添加量混合添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，115℃滅菌30 min，采用相同的培養(yǎng)方法分別培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌，培養(yǎng)結(jié)束后，取菌懸液采用平板計(jì)數(shù)法檢測活菌數(shù)，考察作用較強(qiáng)的促生長因子復(fù)合添加對菌種培養(yǎng)的促生長作用。

2 結(jié)果

2.1 菌株生長曲線測定結(jié)果

如圖1所示，培養(yǎng)基pH值隨著鼠李糖乳桿菌的生長逐漸降低，是由于菌體在其生長代謝過程中產(chǎn)生了大量的乳酸[10]。菌體培養(yǎng)時(shí)間越長，培養(yǎng)基中積累的乳酸越多，導(dǎo)致菌體周圍環(huán)境pH值越低，從而干擾菌體正常代謝，抑制其生長繁殖[11-12]。OD值結(jié)果發(fā)現(xiàn)0～1 h，鼠李糖乳桿菌細(xì)胞的分裂繁殖及生長緩慢，處于延滯期；1～16 h菌體生長速率最快，代時(shí)最短，進(jìn)入生長對數(shù)期；17～24 h，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，乳酸含量升高，環(huán)境pH值下降，OD值上升趨勢逐漸平緩，說明此時(shí)為菌體生長的穩(wěn)定期。根據(jù)鼠李糖乳桿菌HCS01-003菌株生長規(guī)律及生產(chǎn)要求等因素，確定自然發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間定為（16±0.5）h。

圖1 鼠李糖乳桿菌HCS01-003二級培養(yǎng)生長曲線

2.2 菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)溫度對菌體生長的影響

固定接種量為4%，初始pH值為6.60，靜置培養(yǎng)，分別考察不同培養(yǎng)溫度33、35、37、39、41℃條件下菌體吸光度和收率。每個(gè)條件重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。培養(yǎng)溫度直接對細(xì)胞中的酶、蛋白質(zhì)、DNA等大分子的合成與活性產(chǎn)生一定的影響，培養(yǎng)溫度較最適溫度高或低，生長速率都會(huì)隨之下降[13－14]。由表2及圖2可知，鼠李糖乳桿菌HCS01-003的生長隨溫度升高呈上升趨勢，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，測定的OD值及收率均最高，隨后隨溫度的升高呈下降趨勢。故鼠李糖乳桿菌HCS01-003最佳培養(yǎng)溫度為37℃。

表2 培養(yǎng)溫度對菌體生長的影響

圖2 培養(yǎng)溫度對菌體生長的影響

2.2.2 初始pH值對菌體生長的影響

初始pH值對乳酸菌生長具有一定的影響，過低會(huì)使培養(yǎng)基過早酸化，過高則會(huì)堿化培養(yǎng)基，均會(huì)抑制乳酸菌的生長[15]。固定培養(yǎng)溫度為37℃，接種量為4%，靜置培養(yǎng)，分別考察初始pH值為6.40，6.60，6.80，7.00，7.20條件下菌懸液吸光度和菌泥收率。結(jié)果見表3及圖3，鼠李糖乳桿菌HCS01-003適合弱酸環(huán)境下生長，當(dāng)初始pH值為6.80時(shí)，OD值較高，收率明顯高于其他組，為最佳適初始pH值。

圖3 培養(yǎng)基初始pH值對菌體生長的影響

表3 初始pH值對菌體生長的影響

2.2.3 需氧型對菌體生長的影響

固定培養(yǎng)溫度為37℃，接種量為4%，初始pH值為6.80，分別測定靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方式菌懸液吸光度、菌泥收率。表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌HCS01-003更適靜置培養(yǎng)。

表4 需氧型對菌體生長的影響

2.2.4 接種量對菌體生長的影響

不同接種量對菌體的生長存在一定的而影響，過低使菌體生長緩慢，發(fā)酵周期長，過高的接種量又會(huì)導(dǎo)致前期生長快，營養(yǎng)成分不足而提前死亡[15]。固定培養(yǎng)溫度為37℃，初始pH值為6.80，靜置培養(yǎng)，分別考察接種量4%、5%、6%條件下菌懸液的OD值和收率，優(yōu)化接種量。根據(jù)表5及圖4實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨著接種量的增加，OD值和菌泥收率均增加，當(dāng)接種量5%時(shí)，菌泥收率可達(dá)到1.386%?？紤]實(shí)際生產(chǎn)需要及成本等因素，采用接種量5%為優(yōu)化后接種量。

表5 接種量對菌體生長的影響

圖4 接種量對菌體生長的影響

2.2.5 培養(yǎng)條件驗(yàn)證結(jié)果

將經(jīng)過優(yōu)化后培養(yǎng)條件（培養(yǎng)溫度37℃，初始pH值為6.80，5%接種量、靜置培養(yǎng)）下的二級培養(yǎng)菌懸液，以相同條件接種到300 mL優(yōu)化培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)16 h，測定菌懸液的pH值、收率和活菌數(shù)，重復(fù)操作實(shí)驗(yàn)3次取平均值，驗(yàn)證培養(yǎng)條件。驗(yàn)證后所得結(jié)果為活菌數(shù)2.97×109mL-1，菌泥收率1.593。

2.3 優(yōu)化培養(yǎng)基促生長因子篩選結(jié)果

2.3.1 促生長因子單因素篩選結(jié)果

低聚異麥芽糖在動(dòng)物腸道內(nèi)雖無法被機(jī)體消化酶和有害菌如產(chǎn)氣莢膜桿菌分解利用，但卻是乳酸菌、雙歧桿菌等有益微生物定植和生長的良好培養(yǎng)基[16]。體外研究實(shí)驗(yàn)證明低聚半乳糖及水蘇糖等低聚糖對乳酸菌具有明顯的增殖作用[17]，而維生素為乳酸菌生長提供營養(yǎng)。根據(jù)表6和圖5可知，添加了促生長因子后，鼠李糖乳桿菌經(jīng)三級培養(yǎng)后的菌懸液活菌數(shù)與空白對照相比明顯增多，其中添加低聚異麥芽糖的為最多，其次是水蘇糖和低聚半乳糖，維生素B5、維生素B12、維生素B2促生長效果不明顯，這表明所選的促生長因子對該鼠李糖乳桿菌的生長均有一定的促進(jìn)作用，其中促生長作用較顯著的為低聚異麥芽糖、水蘇糖、低聚半乳糖。

表6 單因素篩選菌懸液活菌數(shù)

圖5 單因素篩選菌懸液活菌數(shù)對比結(jié)果

2.3.2 促生長因子添加量篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2.1 低聚異麥芽糖添加量對菌體生長的影響。

根據(jù)圖6所示，隨著低聚異麥芽糖添加量的增加，菌懸液活菌數(shù)先增加后減少。當(dāng)?shù)途郛慃溠刻翘砑恿吭?～2 g/L時(shí)，菌體活菌數(shù)較高，故選用1 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L作為低聚異麥芽糖的實(shí)驗(yàn)水平。

圖6 低聚異麥芽糖添加量對菌體生長的影響

2.3.2.2 水蘇糖添加量對菌體生長的影響。

由圖7可知，菌體活菌數(shù)隨著水蘇糖添加量的增加而加大，當(dāng)添加量為2.0 g/L時(shí)，活菌數(shù)則保持平穩(wěn)狀態(tài)，所以選用1.5、2.0、2.5 g/L作為水蘇糖的實(shí)驗(yàn)水平來考察水蘇糖的最適添加量。

圖7 水蘇糖添加量對菌體生長的影響

2.3.2.3 低聚半乳糖添加量對菌體生長的影響。

由圖8可知，當(dāng)?shù)途郯肴樘翘砑恿繛? g/L時(shí)，活菌數(shù)最高，其次是2.5 g/L和1.5 g/L，故選用1.5、2.0、2.5 g/L作為低聚半乳糖的實(shí)驗(yàn)水平來考察水蘇糖的最適添加量。

圖8 低聚半乳糖添加量對菌體生長的影響

2.3.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表8所示，根據(jù)R值可知，在培養(yǎng)基中復(fù)合添加三個(gè)促生長因子時(shí)對鼠李糖乳桿菌的促生作用順序?yàn)锳＞C＞B，即低聚異麥芽糖＞低聚半乳糖＞水蘇糖。由k值可知，A1B1C2為最優(yōu)組合，即低聚異麥芽糖1 g/L，水蘇糖1.5 g/L，低聚半乳糖2 g/L。2.3.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表7 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表8 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

將正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的最優(yōu)組合，即低聚異麥芽糖1 g/L，水蘇糖1.5 g/L，低聚半乳糖2 g/L（均為質(zhì)量濃度）添加到優(yōu)化培養(yǎng)基中，采用上述相同的方法培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌，培養(yǎng)結(jié)束后，取菌懸液檢測活菌數(shù)，檢測結(jié)果為7.8×109mL-1，活菌數(shù)最高。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，活菌數(shù)僅次于最優(yōu)組合的是僅添加低聚異麥芽糖1.5 g/L和正交實(shí)驗(yàn)1組，結(jié)果均為7.7×109mL-1，均符合生產(chǎn)要求，考慮到生產(chǎn)成本，選擇促生長因子方案為低聚異麥芽糖1.5 g/L。

3 討論

鼠李糖乳桿菌是應(yīng)用最廣泛的益生菌，能夠抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等[18]。然而發(fā)揮益生作用不僅需要代謝產(chǎn)物，菌體活性也十分關(guān)鍵，培養(yǎng)溫度、接種量及初始pH值等培養(yǎng)條件對乳酸菌素產(chǎn)量均有直接或間接影響[19-20]。本研究中培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值及接種量等，隨著培養(yǎng)條件的改變，菌體的生長均會(huì)隨之呈上升或下降趨勢，與菌體生長特性有關(guān)。促生長因子的作用根據(jù)圖5可知，與空白對照相比，低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、水蘇糖、維生素B2、維生素B5、維生素B12對鼠李糖乳桿菌的培養(yǎng)都有促生長作用，而低聚異麥芽糖和水蘇糖的促生長作用較大，可能是因?yàn)榈途郛慃溠刻呛退K糖都具有α-1，6糖苷鍵功能鍵，且聚合度都較低有關(guān)。

4 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了鼠李糖乳桿菌HCS01-003培養(yǎng)條件，以菌懸液OD、菌泥收率及活菌數(shù)為考察指標(biāo)，研究了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值、需氧型及接種量對菌體生長的影響，以優(yōu)化最佳培養(yǎng)條件。選取了6種對鼠李糖乳桿菌生長有促進(jìn)作用的促生長因子，添加到優(yōu)化培養(yǎng)基中，根據(jù)菌株在培養(yǎng)基上的菌落生長情況來研究6種促生長因子對鼠李糖乳桿菌生長的促進(jìn)作用，并從中篩選出最佳的促生長因子及復(fù)合添加的最優(yōu)組合。

培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果最適培養(yǎng)溫度為37℃、培養(yǎng)基初始pH值為6.8、接種量5%、靜置培養(yǎng)。通過單因素篩選實(shí)驗(yàn)，確定了6種促生長因子對該鼠李糖乳桿菌的促生長作用依次為低聚異麥糖、水蘇糖，低聚半乳糖、維生素B5、維生素B12、維生素B2。選取了促生長作用較顯著的低聚異麥芽糖、水蘇糖，低聚半乳糖進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，篩選了復(fù)合添加的最優(yōu)組合，考慮到生產(chǎn)成本因素，確定促生長因子方案為添加低聚異麥芽糖1.5 g/L。經(jīng)最適培養(yǎng)條件及添加優(yōu)選促生長因子的優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌HCS01-003菌懸液活菌數(shù)可達(dá)7.7×109cfu/mL。