李磊，周貽兵，張權(quán)，林野，李海暢，郭華

（1.貴州省疾病預防控制中心實驗中心理化科，貴陽550001；2.貴陽市疾病預防控制中心理化科，貴陽550001）

0 引言

喹諾酮類抗生素是一類人工合成的廣譜抗菌藥，由于容易獲得且價格較低而被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)[1]。近年來隨著喹諾酮類抗生素在動物養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用，動物源性食品中出現(xiàn)喹諾酮類藥物殘留的風險日趨增加[2]。長期食用喹諾酮類抗生素超標的食物會影響兒童骨骼發(fā)育并產(chǎn)生皮膚及神經(jīng)毒性[3-5]，相關(guān)研究顯示乳制品中喹諾酮抗生素主要來源于對泌乳期奶牛的不合理用藥[6]及防止乳制品變質(zhì)而特意添加[7]。目前，美國、歐盟、日本都對喹諾酮類藥物制定了最大殘留限量[8]，我國也對恩諾沙星、達氟沙星等喹諾酮類抗生素做出了限量規(guī)定[9]。因此有必要建立乳制品中的喹諾酮殘留量篩查方法。

喹諾酮類藥物的主要檢測方法有薄層色譜法[10]，酶聯(lián)免疫法[11-13]，高效液相色譜法[14-15]及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[16-19]，而前處理技術(shù)主要包括固相萃取凈化[16-19]及QuEChERS凈化技術(shù)[8，20]，經(jīng)典的固相萃取方法雖然重現(xiàn)性穩(wěn)定，但操作繁瑣，對操作人員能力要求較高[21]，而QuEChERS方法操作簡便，前處理過程簡單[22-25]，更適合快速篩查工作。而目前已有報道的乳制品中QuEChERS凈化方法主要以碳18（C18）作為主要凈化材料[8]，但C18凈化難以去除乳制品中脂類基質(zhì)，影響方法回收率表現(xiàn)。該研究以改良型QuECh-ERS凈化并采用高通量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行乳制品中喹諾酮篩查，通過特定凈化填料除去乳制品中脂肪基質(zhì)并使用乙腈沉淀蛋白，該方法能夠在獲得穩(wěn)定分析結(jié)果的同時簡化操作流程，適用于乳制品中喹諾酮類化合物的快速篩查工作。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星、達氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星、西諾沙星標準品，德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），美國飛世爾試劑公司；試劑凈化包（EMR QuEChERS），安捷倫科技有限公司；采集市售巴氏滅菌鮮奶及原味酸奶各5個批次作為測試樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

U 3000型超高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾公司；TSQ Quantum型三重四極桿質(zhì)譜儀，美國賽默飛世爾公司；3-30KS型高速離心機，德國賽多利斯公司；Milli-Q型超純水機，美國密理博公司。

1.3 樣品前處理方法

取5.0 g乳制品樣品于15 mL離心管中，加入EMR QuEChERS凈化填料后加入5 mL乙腈旋渦混勻5 min，室溫下7 000 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至含有3 g無水硫酸鎂，2 g氯化鈉的15 mL離心管中，震蕩混勻后7 000 r/min離心10 min，取上層乙腈層2.0 mL經(jīng)氮氣吹干后，用流動性初始比例定容至2.0 mL，經(jīng)10 000 r/min離心5 min后轉(zhuǎn)移至進樣小瓶中進行檢測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold，2.1 mm×200 mm，1.9μm；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：甲醇-乙腈混合溶液（40∶60，v/v）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；進樣量10μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源模式：電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；儀器參數(shù)：噴霧電壓為3 500 V，離子源溫度為320℃，脫溶劑溫度為300℃，輔助氣（N2）10 psi，鞘氣（N2）34psi；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM模式，化合物質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜多組分檢測中常出現(xiàn)離子共流出現(xiàn)象而導致定量結(jié)果偏差，而喹諾酮類化合物由于具有相似的母核結(jié)構(gòu)，較難進行色譜行為分離導致共流出現(xiàn)象影響定量結(jié)果。因此需要建立合理的色譜條件來避免具有相近碎片離子的分析化合物間的共流出。本研究通分別優(yōu)化甲醇、乙腈及甲醇乙腈不同比例混合溶液的色譜分離條件，在使Hypersil Gold色譜柱（200 mm×2.1 mm，1.9μm）時，0.1%甲酸水溶液-乙腈流動相分離效果差，表現(xiàn)為依諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星等無法獲得滿意的分離度，推測原因為乙腈洗脫能力過強而導致分離效果較差。為改善乙腈洗脫能力在有機相中加入甲醇，可降乙腈洗脫能力，但在改為0.1%甲酸水溶液-甲醇流動相后，出現(xiàn)沙拉沙星、氧氟沙星等化合物響應(yīng)值降低現(xiàn)象。通過調(diào)整有機相甲醇乙腈比例后，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸水溶液-甲醇-乙腈混合溶液（40∶60，v/v）流動相能獲得洗脫效果與化合物相應(yīng)強度的平衡，獲得10種喹諾酮類化合物的較好分離結(jié)果，有效的避免了具有相近碎片離子化合物的共流出對定量的干擾（圖1）。

圖1 10種喹諾酮類抗生素色譜圖

2.2 不同凈化方法對比

在現(xiàn)有的報道中，對于乳制品中喹諾酮檢測的凈化方式多采用以親水親脂平衡型固相萃取小柱來完成對樣品的凈化[16-19]，而已有的QuEChERS方法對乳制品中喹諾酮凈化方法的研究多限于使用C18材料來進行凈化[8]，難以去除油脂類基質(zhì)干擾。本研究采用EMR QuEChERS填料對乳制品中喹諾酮進行凈化，相對于固相萃取凈化方法可以快速的完成樣品凈化操作，比使用C18凈化有更為理想的油脂基質(zhì)去除效率。本研究通過向經(jīng)測試的空白牛奶樣品中加入20.0μg/kg的喹諾酮混標，使用親水親脂平衡型固相萃取小柱與QuEChERS方法進行不同凈化方法比較，測定結(jié)果顯示親水親脂平衡型固相萃取小柱加標回收率在67.3%～82.1%間，方法精密度范圍為5.43%～12.57%，本方法的QuEChERS凈化方法回收率在72.3%～93.3%間，方法精密度范圍為5.80%～10.88%。由結(jié)果可見，QuEChERS凈化方法在氧氟沙星及西諾沙星中獲得了優(yōu)于固相萃取凈化的回收率，其余喹諾酮類化合物兩種凈化方法的回收率相當，但QuECh-ERS凈化方法更易操作，適合快速篩查檢測。

表3 不同前處理方法加標回收率結(jié)果（n=6）

2.3 方法線性范圍及檢出限與定量限

將喹諾酮混合標準溶液使用流動性初始比例配置標準曲線，以峰面積對濃度（μg/L）繪制標準曲線。以響應(yīng)值3倍信噪比（S/N）時所對應(yīng)質(zhì)量濃度（μg/kg）為檢出限，10倍信噪比（S/N）時所對應(yīng)的質(zhì)量濃度（μg/kg）作為定量限，線性回歸方程、檢出限和定量限見表4。

表4 方法線性回歸方程與檢出限、定量限

2.4 方法準確度與精密度

將經(jīng)過空白測試的牛奶樣品加入低、中、高3個濃度組喹諾酮混標進行加標回收率實驗，每個濃度組6組平行樣，以1.3所述樣品前處理方法進行前處理后上機進行測定。根據(jù)加標量及測定結(jié)果計算方法加標回收率范圍及精密度范圍。結(jié)果顯示在10.0，50.0，100.0μg/kg加標濃度下，方法加標回收率范圍在63.2～96.7%之間，方法精密度范圍為4.32～11.42%之間。

2.5 樣品檢測

隨機抽取市售鮮牛奶樣品5個批次、酸奶5個批次使用上述方法進行前處理后檢測，均未檢出上述10種喹諾酮類抗生素。檢測結(jié)果見表6。

表6 市售巴氏滅菌鮮奶及原味酸奶測定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了乳制品中10種喹諾酮類抗生素的QuEChERS凈化-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速篩查方法。通過EMR QuEChERS進行乳制品樣品凈化具有前處理簡單、快速的特點，10中喹諾酮化合物在5.0～150μg/L范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，方法檢出限為1.0μg/kg，定量限為3.0μg/kg。在10.0，50.0，100.0μg/kg加標濃度下，加標回收率范圍在63.2～96.7%之間，精密度范圍為4.32%～11.42%之間，方法靈敏度及精密度良好，能夠滿足乳制品中10種喹諾酮類抗生素的快速篩查需求。

表5 方法的回收率和精密度（n=6）