刁夢雪，顏蜜，陳思如，楊婉露，宋一帆，銀雪，張鐵華

（吉林大學食品科學與工程學院，長春130062）

0 引言

α-乳白蛋白是乳清中分子量最小的乳蛋白，含量約為1.2 g/L[1-2]。α-乳白蛋白富含色氨酸[3]，其在嬰幼兒的生長發(fā)育過程中起重要作用，它可以提升嬰幼兒的睡眠質(zhì)量[4]、改善情緒以及提高食欲。同時，α-乳白蛋白更容易被嬰幼兒的胃腸道吸收，蛋白質(zhì)被消化降解產(chǎn)生的抗菌肽，可以參與調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡[5]。

α-乳白蛋白是人乳中含量最多的功能蛋白[6]。據(jù)報道，來自牛源與人源中的α-乳白蛋白有74%的氨基酸相同[7]，在功能和結(jié)構(gòu)上二者較為相近。因此，提升嬰幼兒配方奶粉中α-乳白蛋白的含量，可以使之更接近母乳的組成[8-10]，在嬰幼兒的生長發(fā)育階段中滿足營養(yǎng)需求[11]。

常見的α-乳白蛋白的分離純化技術(shù)有鹽析法[12]、等電點沉淀法[13]、選擇性熱聚合法[14-15]、雙水相萃取法[16]、膜分離法[17]及色譜純化法[18-19]等。鹽析法和等電點沉淀法經(jīng)常結(jié)合使用，是目前常用的工業(yè)化大規(guī)?；厥咋?乳白蛋白的方法，但獲得的蛋白還需要去除鹽離子，且蛋白純度較低。選擇性熱聚合法和雙水相萃取法目前在工業(yè)應(yīng)用上尚不成熟，仍停留在實驗室級別。膜分離法是一種綠色的物理分離方法[20-21]，在分離過程中無熱及化學變化，不會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。因此，膜分離法是工業(yè)級分離α-乳白蛋白的關(guān)鍵技術(shù)之一[22]，其缺點是分離過程中會造成膜污染，α-乳白蛋白的回收率較低。色譜純化法是分離得到高純度α-乳白蛋白最有效的技術(shù)，且回收率很高，該技術(shù)目前較為成熟。

本文提供了一種牛乳中α-乳白蛋白的分離純化工藝。第一階段，以牛乳為原料，經(jīng)過脫脂后利用膜分離法分段回收乳蛋白，可以得到富集α-乳白蛋白的截留液，即α-乳白蛋白粗品。以不同孔徑的超濾膜分段截留乳蛋白，可以減少膜污染，提高分離效率，獲得低純度的α-乳白蛋白。第二階段，以蛋白粗品為原料，采用色譜法分離純化，相較于直接從乳清中分離，可以獲得更高純度的α-乳白蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮牛乳，吉林春光乳業(yè)有限公司；CHY-MAX凝乳酶（～2235 IMCU/g），科漢森公司；乳酸，鄭州康本生物科技有限公司；檸檬酸，濰坊英軒實業(yè)有限公司；鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀，北京化工廠；凱氏定氮催化片，青島雅各化學試劑有限公司；SDS-PAGE試劑盒，碧云天生物技術(shù)；α-乳白蛋白標準品（≥92.2%），美國Agropur公司；管式陶瓷膜（0.1μm、0.45μm）、卷式聚砜膜（100 ku、50 ku、10 ku）、10 ku再生纖維素膜，北京賽普瑞特設(shè)備有限公司；DEAE Sepharose Fast Flow，美國GE公司；Waters Symmetry?C18液相色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），美國Waters公司；乙腈、三氟乙酸（色譜純），美國Tedia公司；其它試劑，均為國產(chǎn)分析純。

Beckman CouLTER AvantiJ-E高速離心機，美國貝克曼公司；ZY-MU-4-1000中試型微濾超濾膜分離系統(tǒng)、ZY-UNR-4040中試型超濾膜分離系統(tǒng)，上海紫裕生物科技有限公司；蓋勃離心機，吉林省圣澤科技有限公司；K1100全自動凱氏定氮儀，海能未來技術(shù)集團股份有限公司；Chemi Doc凝膠成像儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳系統(tǒng)，美國伯樂公司；DHL-A電腦恒流泵、CXG-1電腦恒溫層析柜、HD-3紫外檢測儀，上海青浦滬西儀器廠；DGU-20A3高效液相色譜儀，日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳脂肪的分離

將市售鮮牛乳預(yù)熱至38～42℃，采用離心法將牛乳離心脫脂，離心轉(zhuǎn)數(shù)為7 000 r/min，離心后分別得到脫脂乳和稀奶油。利用蓋勃法測定鮮牛乳、稀奶油和脫脂牛乳中的乳脂肪含量，采用凱氏定氮法測定3種樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.2.1.1 乳脂肪的含量測定

樣品中乳脂肪的含量測定參照GB 5413.3-2010[23]。用蒸餾水將濃硫酸按1∶9的比例稀釋成90%的硫酸。在乳脂計中依次加入90%硫酸、樣品、蒸餾水和異戊醇，體積比為10∶5∶6∶1，上下震蕩使溶液混勻。將乳脂計置于蓋勃離心機中離心數(shù)次，直至脂肪層上浮。讀乳脂計上的示數(shù)，其數(shù)值的2.2倍即為樣品中乳脂肪的含量。

1.2.1.2 蛋白質(zhì)的含量測定

樣品中蛋白質(zhì)的含量測定參照GB 5009.5-2010[24]。設(shè)置實驗組及對照組，實驗組在消化管加入樣品、催化片及濃硫酸，對照組加入等量的催化片和濃硫酸。將樣品消化，當其顏色變?yōu)榱辆G色時停止加熱，消化溶液的溫度恢復至室溫后，利用全自動凱氏定氮儀滴定樣品，計算蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 酪蛋白沉淀及乳清的分離

比較酸沉法和酶凝法分離酪蛋白的效果。以1.2.1中回收得到的脫脂乳為原料，分別使用檸檬酸、鹽酸、乳酸和凝乳酶處理脫脂乳。分別使用1 mol/L的鹽酸、乳酸和檸檬酸調(diào)節(jié)等體積脫脂乳的pH至4.6，37℃靜置1 h后回收上清液。同樣的，在等體積脫脂乳中添加0.01%（w/w）的凝乳酶，混合均勻，37℃靜置1 h后回收上清溶液。按照實驗1.2.1.2操作步驟，測定分離得到的上清液中蛋白質(zhì)的含量，選擇最佳的分離乳清的方法。

1.2.3 乳清的微濾除菌

回收1.2.2中最佳處理法得到的乳清，調(diào)節(jié)pH為6.8，在35℃、出口壓力為0.2 MPa的條件下經(jīng)陶瓷膜過濾，截留上清液中的細菌。選擇0.1μm和0.45μm的陶瓷膜過濾上清液，將過濾后回收的截留液用去離子水稀釋到原來體積，再次過濾，該過程重復兩次，提升透過液蛋白含量。收集微濾的截留液和透過液，分別檢測其蛋白質(zhì)含量和細菌數(shù)量，計算細菌去除率，細菌數(shù)量采用平板計數(shù)法（GB4789.2-2016）[25]。

1.2.4 超濾富集α-乳白蛋白

回收1.2.3微濾得到的乳清蛋白溶液，在35℃、出口壓力為0.2 MPa的條件下，經(jīng)10 ku的超濾聚砜膜和再生纖維素膜過濾，收集經(jīng)兩種膜材過濾得到的截留液，測定其蛋白質(zhì)含量，篩選最佳的超濾膜材。以最佳超濾膜材分段富集α-乳白蛋白。

選用100 ku超濾膜截留乳清中的大分子蛋白，回收濾過液Ⅰ，經(jīng)50 ku超濾得濾過液Ⅱ，濾過液Ⅱ經(jīng)10 ku的超濾膜截留后，回收截留液Ⅰ，即得富集α-乳白蛋白的溶液組分。由于α-乳白蛋白主要存在于截留液Ⅰ中，根據(jù)設(shè)備最佳反應(yīng)溫度范圍，設(shè)置10 ku超濾膜的膜過濾溫度，超濾溫度分別為25℃、35℃、45℃，調(diào)節(jié)膜壓力為0.1、0.2、0.3 MPa，對每組實驗得到的截留液進行蛋白質(zhì)含量測定，確定最佳的超濾條件。在最佳反應(yīng)條件下回收得到富集α-乳白蛋白的溶液，通過高效液相色譜法計算純度。

1.2.4.1 高效液相色譜檢測條件

使用Waters Symmetry?C18液相色譜柱對分離得到的α-乳白蛋白粗品進行檢測分析。色譜檢測條件：流動相A為含1%三氟乙酸的水溶液，流動相B為含1%三氟乙酸的乙腈溶液，檢測流速為0.5 mL/min，進樣體積為10μL，檢測波長為280 nm，柱溫為25℃，洗脫梯度條件如表1所示。

表1 高效液相色譜流動相梯度洗脫條件

1.2.5 陰離子交換色譜法分離純化α-乳白蛋白

回收1.2.4中得到的α-乳白蛋白粗品，經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜進行純化。將α-乳白蛋白粗品加到DEAE Sepharose Fast Flow凝膠柱中，使用含0～0.3 mol/L NaCl的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，收集目標蛋白溶液，透析24 h后濃縮，得到純度較高α-乳白蛋白溶液。采用高效液相色譜測定其純度，檢測條件同1.2.4.1所述?；厥盏摩?乳白蛋白溶液，在進料溫度為135℃、出料溫度為70℃的條件下噴霧干燥，制備純度較高的α-乳白蛋白粉。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)取3次平行試驗的平均值，樣品間差異利用單因素方差分析進行比較。采用SPSSStatistics 19進行統(tǒng)計學分析，用GraphPad Prism 8作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳脂肪的分離

牛乳、脫脂乳和稀奶油的脂肪及蛋白質(zhì)含量變化如圖1所示，3者的蛋白質(zhì)含量差別較小，牛乳的乳脂肪含量為3.7±0.0136%。離心脫脂后，脫脂乳的乳脂肪含量為0.044±0.0016%。脫脂過程中會造成部分蛋白質(zhì)損失，損失率為10.132±0.0126%。

圖1 鮮牛乳脫脂前后脂肪及蛋白質(zhì)含量比較

2.2 酪蛋白沉淀及乳清的分離

實驗比較了4種回收乳清的方法?？梢园l(fā)現(xiàn)，乳酸凝乳后分離出的酪蛋白顆粒較大，鹽酸凝乳酪蛋白顆粒較小，檸檬酸介于中間。圖2是不同分離方法回收乳清的電泳圖，泳道M是標準蛋白，泳道1～5分別為檸檬酸、鹽酸、乳酸和凝乳酶處理后回收的乳清。根據(jù)電泳圖的條帶對比發(fā)現(xiàn)，酸沉法和酶凝法回收的乳清中幾乎沒有酪蛋白條帶，說明酪蛋白去除率較高。如表2所示，乳酸和凝乳酶作用后回收的乳清中蛋白質(zhì)含量較高。綜合考慮實驗結(jié)果，最終采用酸沉法回收乳清，且乳酸為分離酪蛋白和乳清的最佳試劑。

表2 不同分離方法回收乳清中蛋白含量比較

圖2 不同分離方法回收乳清的電泳圖

2.3 乳清的微濾除菌

如圖3所示，比較了兩種孔徑的陶瓷膜微濾乳清后截留液和濾過液中的蛋白質(zhì)含量，0.45μm孔徑微濾膜透過液蛋白質(zhì)含量高于0.1μm的陶瓷膜，兩組不同孔徑的膜對乳清微濾后的除菌率可達99%以上。經(jīng)過0.45μm陶瓷膜處理的濾過液蛋白質(zhì)含量為6.53±0.22 mg/mL。綜合除菌率和濾過液蛋白質(zhì)含量，選擇0.45μm孔徑的陶瓷膜對乳清進行微濾處理。

2.4 超濾富集α-乳白蛋白

經(jīng)50 ku聚砜膜獲取得到的濾過液蛋白質(zhì)含量為0.2294±0.0145 mg/mL。同等質(zhì)量的透過液經(jīng)兩種不同材質(zhì)超濾膜過濾，回收的截留液中蛋白質(zhì)的含量分別為0.1884±0.0279 mg/mL和0.1790±0.0239 mg/mL，經(jīng)聚砜膜超濾回收的蛋白質(zhì)含量高于再生纖維素膜。因此選擇10 ku的超濾膜材來截留富含α-乳白蛋白的濾液。

不同條件下10 ku聚砜膜截留液蛋白質(zhì)含量如圖4所示，在不同溫度和壓力下比較超濾截留液中蛋白質(zhì)含量。結(jié)果顯示，聚砜膜在35℃、0.3 MPa的條件下，對乳清的超濾效果較好，截留液中的蛋白質(zhì)含量高于其他實驗組。

圖4 不同條件下10 ku聚砜膜截留液蛋白質(zhì)含量

綜上，使用聚砜超濾膜對乳清中的蛋白分段截留，在最佳超濾條件下回收富集了α-乳白蛋白的截留液，按照1.2.4.1的高效液相色譜檢測條件，測定樣品中α-乳白蛋白的含量如圖5所示，經(jīng)計算，超濾樣品中α-乳白蛋白的含量為24.28±0.32%。

圖5 α-乳白蛋白粗品高效液相色譜圖

2.5 陰離子交換色譜分離純化α-乳白蛋白

利用DEAE Sepharose Fast Flow二次純化超濾回收的α-乳白蛋白粗品，洗脫液梯度洗脫后，回收洗脫液，透析24 h。經(jīng)過高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn)，如圖6所示，經(jīng)陰離子交換色譜純化的蛋白樣品中含較少量β-乳球蛋白。經(jīng)陰離子交換色譜純化的樣品中，α-乳白蛋白的純度為90.89±0.31%，在乳清中的回收率為79.02±0.13%。

圖6 色譜純化后α-乳白蛋白高效液相色譜圖

3 結(jié)論

經(jīng)離心法脫脂處理的牛乳，乳脂肪回收率可達99%以上。實驗比較了不同酪蛋白沉淀的方法，以乳清中蛋白質(zhì)含量為指標，最終選擇乳酸沉淀酪蛋白，獲得的乳清蛋白質(zhì)含量為11.2267±0.0240 mg/mL。乳清溶液經(jīng)0.45μm孔徑的陶瓷膜微濾除菌后，選擇10 ku的卷式聚砜膜超濾富集α-乳白蛋白，優(yōu)化超濾參數(shù)，在35℃、出口壓力為0.3 MPa的條件下，超濾截留液中蛋白質(zhì)含量最高，樣品中α-乳白蛋白的含量為24.28±0.32%。利用陰離子交換色譜將α-乳白蛋白粗品二次純化，獲得的α-乳白蛋白純度可達90.89±0.31%，在乳清中的回收率為79.02±0.13%。