夏 冰 洪 滔

根尖周炎是一類發(fā)生于根尖周組織的炎癥性疾病，主要是由于病原菌及相關代謝產(chǎn)物與宿主免疫系統(tǒng)相互作用而導致[1-2]。人牙周膜干細胞（hPDLSCs）是一組來源于牙周膜的間充質(zhì)干細胞，具有分化為成骨細胞、成纖維細胞和牙齒成牙骨質(zhì)細胞的多能性[3-4]。根尖周炎時，牙周優(yōu)勢菌脂多糖（LPS）對根尖周軟硬組織造成不同程度的破壞，降低hPDLSCs 的成骨分化能力[5]，然而其相關機制有待進一步研究。同時，研究發(fā)現(xiàn)活性氧（ROS）與骨代謝紊亂性疾病密切相關[6]。黃酮類小分子白楊黃素，化學名為5，7-二羥基黃酮，具有顯著的抗病毒、抗過敏、抗腫瘤的作用[7]。研究證實，白楊黃素能夠促進成骨細胞系MC3T3-E1 成骨分化相關基因的表達[8]。然而關于白楊黃素對炎癥微環(huán)境下牙周膜干細胞的成骨分化的影響鮮有報道。P.g LPS 是革蘭陰性細菌牙齦卟啉單胞菌細胞壁中具有特殊結構的脂質(zhì)成分，為牙周病重要毒力因子，使牙周膜干細胞成骨能力降低[9]。本實驗采用P.g LPS 模擬hPDLSCs 炎癥氧化應激環(huán)境，通過檢測ROS、抗氧化及成骨因子mRNA 表達水平，探討白楊黃素對炎癥環(huán)境狀態(tài)下hPDLSCs 成骨分化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床根尖周炎組織樣本 選擇2017 年8 月—2017 年12 月就診于浙江省中西醫(yī)結合醫(yī)院牙體牙髓門診的患者，其無全身系統(tǒng)性疾病，3 個月內(nèi)未服用抗生素及抗氧化劑，反復進行完善的根管治療后病變未愈合，且牙周探診深度＜3mm，無牙根縱裂，欲行根尖手術的單根牙20 顆。

1.2 主要試劑儀器 牙齦卟啉單胞菌脂多糖（P.g LPS，批號SMB00610，Sigma，美國）；α-MEM 培養(yǎng)基（批號12492-013，Gbico 公司，美國）；Ⅰ型膠原酶（批號17100-017，Invitrogen 公司，美國）、Dispase 酶（批號354235，HyClone 公司，美國）；白楊黃素（純度：≥98%，批號480-40-01，上海西格生物科技有限公司）、MTT 試劑盒（ALP，批號CGD-1，Sigma 公司，美國）；堿性磷酸酶活性測試試劑盒（批號A059-2，南京建成生物工程研究所）；Trizol（批號15596-026，Invitrogen 公司，美國）；PrimeScriptTM RT 試劑盒（批號RR036A，TaKaRa，日本）；SYBR-Green Real time PCR MIX（批號RR820A，TaKaRa，日本）；酶標分析儀（1681130A，Bio-Rad，美國）；倒置顯微鏡（IX73 熒光，Olympus 公司，日本）；實時熒光定量PCR 儀（QuantStudio 7 Flex，賽默飛，美國）。

1.3 分離和培養(yǎng)hPDLSCs 征得患者知情同意，取根中1/3 牙周膜組織，加入3g/L 的Ⅰ型膠原酶和4g/L的Dispase 酶，37℃消化1h。終止消化，將分離的細胞平鋪于6 孔板中，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液2mL，37℃、體積分數(shù)5%CO2孵箱中，靜置培養(yǎng)。每3 天換液1 次，棄去未貼壁的細胞。待細胞鋪滿6 孔板底80%后，傳代，實驗均取第4～7 代細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 成脂誘導 將1×105個hPDLSCs 接種在6 孔培養(yǎng)皿中，次日換成脂誘導液（100nmol/L 地塞米松、10mg/L 胰島素、0.5mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、50mmol/L 吲哚美辛、α-MEM 培養(yǎng)基）進行誘導，每3 天換液1 次。21 天后進行油紅染色，倒置顯微鏡下觀察是否有脂滴形成。

1.5 成骨誘導 將1×105個hPDLSCs 以成骨誘導液（含50mg/L 抗壞血酸、1μmol/L 地塞米松、3mmol/L β甘油磷酸鈉）培養(yǎng)。每3 天換液1 次。連續(xù)誘導21 天后進行茜素紅染色，觀察礦化結節(jié)形成。

1.6 流式細胞術鑒定hPDLSCs 表面標記物 取第4代hPDLSCs，細胞密度調(diào)至2×109/L；將細胞分裝于EP 管中，加入相應的抗體2μL，室溫避光孵育1h，離心棄上清后冷PBS 洗3 次，用500μL 含10%胎牛血清的PBS 重懸，4℃避光保存。用流式細胞儀檢測Stro-1、CD146、CD29、CD105、CD34、CD45 表面標記物的表達情況。

1.7 MTT 檢測不同濃度P.g LPS 及白楊黃素對hPDLSCs 增殖活力的影響 將第4 代hPDLSCs，以3×103個/孔接種于96 孔板，常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h 后，對照組細胞用α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，P.g LPS組分別加入1、10、100、1000ng/mL P.g LPS 的α-MEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96h。此外，白楊黃素對hPDLSCs 增殖活力的影響，細胞以3×103個/孔的密度接種于96 孔板24h 后，用白楊黃素（0.1、0.4、1.6、6.25、25、50、100μmol/L）分別作用細胞48、96h。各組到達實驗時間節(jié)點后，加入MTT，孵育4h 后加入DMSO 溶解結晶，并室溫下振蕩15min，于酶標儀檢測OD 值，取5 孔平均值進行分析。

1.8 白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs 的ROS 及抗氧化應激因子表達的影響 將第4 代細胞按1×105個/孔接種于6 孔板常規(guī)培養(yǎng)至貼壁。貼壁后，將常規(guī)培養(yǎng)液置換為成骨誘導液，將細胞分為成骨誘導組及1000ng/mL P.g LPS+成骨誘導組。誘導培養(yǎng)24、48、72、96h 后，取細胞培養(yǎng)液按ROS 檢測試劑盒的使用說明檢測ROS 的含量。收集細胞，提取RNA，q-PCR 檢測錳超氧化物歧化酶（MnSOD），銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/ZnSOD）和過氧化氫酶（CAT）mRNA表達。在此研究基礎上，將第4 代細胞按1×105個/孔接種于6 孔板常規(guī)培養(yǎng)至貼壁。將常規(guī)培養(yǎng)液更換為成骨誘導液，將細胞分為成骨誘導組：10% FBS 的成骨誘導液普通條件培養(yǎng)；P.g LPS+成骨誘導液組：1000ng/mL P.g LPS 的10% FBS 的成骨誘導液培養(yǎng)組；白楊黃素+成骨誘導液+P.g LPS 組：25μmol/L 白楊黃素+1000ng/mL P.g LPS 的10% FBS 的成骨誘導液培養(yǎng)液，作用72h 后，再次檢測白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs 的ROS 及抗氧化應激因子表達。

1.9 白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs 的ALP 活性及成骨分化因子表達的影響 將第4 代細胞按1×105個/孔接種于6 孔板常規(guī)培養(yǎng)至貼壁。將細胞分為三組，分別為常規(guī)10% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)組；10% FBS 的成骨誘導液培養(yǎng)組；1000ng/mL P.g LPS 的10% FBS 的成骨誘導液培養(yǎng)組。分別于第3、7、14 天按ALP 活性檢測試劑盒的使用說明檢測ALP 活性。收集細胞，提取細胞總RNA，q-PCR 檢測細胞Runt 相關轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）、鋒指結構轉(zhuǎn)錄因子（OSX）、ALP 和骨鈣素（OCN mRNA）表達。在此研究基礎上，將第4 代細胞按1×105個/孔接種于6孔板常規(guī)培養(yǎng)至貼壁。將常規(guī)培養(yǎng)液更換為成骨誘導液，將細胞分為成骨誘導組：10% FBS 的成骨誘導液普通條件培養(yǎng)；P.g LPS+成骨誘導液組：1000ng/mL P.g LPS 的10% FBS 的成骨誘導液培養(yǎng)組；白楊黃素+成骨誘導液+P.g LPS 組：25μmol/L 白楊黃素+1000ng/mL P.g LPS 的10% FBS 的成骨誘導液培養(yǎng)液，作用72h 后，再次檢測白楊黃素對P.g LPS介導hPDLSCs 的ALP 活性及成骨分化因子表達。

1.10 q-PCR 以Trizol 試劑提取P.g LPS 或白楊黃素處理細胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄成互補脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），然后按試劑說明書進行PCR 擴增，反應在實時熒光定量PCR 儀上進行。PCR 反應條件為預變性95℃，0.5min，1 個循環(huán)；變性95℃，0.05s，退火60℃，34s，延伸95℃，0.15s，共40 個循環(huán)，終延伸60℃，1min。之后采用2-ΔΔCt法計算目的基因MnSOD、Cu/ZnSOD、CAT、RUNX2、OSX、ALP、OCN 相 對 表 達量，各基因引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列

1.11 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示。兩組間比較采用兩個獨立樣本的LSD-t 檢驗，多組間樣本比較應用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行統(tǒng)計分析；P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測hPDLSCs 采用酶解組織消化培養(yǎng)的原代細胞，3～7 天即有細胞由組織周圍爬出。進一步以有限稀釋法獲得較為純化的hPDLSCs。該細胞呈紡錘型，旋渦狀生長。成脂誘導21 天，發(fā)現(xiàn)紅色脂滴（見圖1A）。成骨誘導21 天后，茜素紅染色hPDLSCs 形成紅色礦化結節(jié)（見圖1B）。流式細胞儀結果顯示，第4 代hPDLSCs 表面抗原Stro-1、CD146、CD29、CD105 均為陽性，CD34、CD45 均為陰性（見圖1C）。

圖1 分離和鑒定牙周膜干細胞

2.2 P.g LPS 對hPDLSCs 增殖能力的影響 MTT 結果顯示，與對照組比較，1000ng/mL P.g LPS 在作用72、96h 后，hPDLSCs 增殖能力隨之減弱（P 均＜0.05）。因此，本研究選用1000ng/mL P.g LPS 作用hPDLSCs 進行后續(xù)實驗。見表2。

表2 P.g LPS 對hPDLSCs 增殖能力的影響（OD 值，±s）

表2 P.g LPS 對hPDLSCs 增殖能力的影響（OD 值，±s）

注：對照組為PBS 處理24h；P.g LPS A 組為1ng/mL P.g LPS 分別處理24、48、72、96h；P.g LPS B 組為10ng/mL P.g LPS 分別處理24、48、72、96h；P.g LPS C 組為100ng/mL P.g LPS 分別處理24、48、72、96h；P.g LPS D 組為1000ng/mL P.g LPS 分別處理24、48、72、96h；P.g LPS為牙齦卟啉單胞菌脂多糖；hPDLSCs 為人牙周膜干細胞；OD 為光密度；與對照組同期比較，aP＜0.05；與同組作用24h 時比較，bP＜0.05

2.3 白楊黃素對hPDLSCs 活力的影響 與白楊黃素對照組比較，50 和100μmol/L 的白楊黃素處理hPDLSCs 48、96h 后顯著降低hPDLSCs 增殖活性（P均＜0.05）；因此，本研究選用25μmol/L 的白楊黃素處理hPDLSCs 進行后續(xù)實驗，見表3。

表3 白楊黃素對hPDLSCs 細胞活力的影響（%，±s）

表3 白楊黃素對hPDLSCs 細胞活力的影響（%，±s）

注：白楊黃素對照組為PBS 分別處理48、96h；白楊黃素A 組為0.1μmol/L 白楊黃素分別處理48、96h；白楊黃素B 組為0.4μmol/L白楊黃素分別處理48、96h；白楊黃素C 組為1.6μmol/L 白楊黃素分別處理48、96h；白楊黃素D 組為6.25μmol/L 白楊黃素分別處理48、96h；白楊黃素E 組為25μmol/L 白楊黃素分別處理48、96h；白楊黃素F 組為50μmol/L 白楊黃素分別處理48、96h；白楊黃素G 組為100μmol/L 白楊黃素分別處理48、96h；與白楊黃素對照組比較，aP＜0.05

2.4 白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs 氧化應激的影響 ROS 含量檢測結果顯示，與成骨誘導液培養(yǎng)細胞比較，P.g LPS 作用的細胞ROS 含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MnSOD、Cu/ZnSOD和CAT mRNA 表達水平在72、96h 明顯降低（P＜0.05），見表4。

表4 P.g LPS 介導hPDLSCs 的ROS、MnSOD、Cu/ZnSOD 和CAT mRNA 表達的影響（±s）

表4 P.g LPS 介導hPDLSCs 的ROS、MnSOD、Cu/ZnSOD 和CAT mRNA 表達的影響（±s）

注：ROS 為活性氧；MnSOD 為錳超氧化物歧化酶；Cu/ZnSOD 為銅鋅超氧化物歧化酶；CAT 為過氧化氫酶；與成骨誘導液組同期比較，aP＜0.05

此外，P.g LPS+成骨誘導液+白楊黃素組與P.g LPS+成骨誘導液組比較，白楊黃素顯著逆轉(zhuǎn)氧化應激因子的表達（P 均＜0.05）。見表5。

表5 白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs 的ROS、MnSOD、Cu/ZnSOD 和CAT 表達的影響（±s）

表5 白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs 的ROS、MnSOD、Cu/ZnSOD 和CAT 表達的影響（±s）

注：ROS 為活性氧；MnSOD 為錳超氧化物歧化酶；Cu/ZnSOD 為銅鋅超氧化物歧化酶；CAT 為過氧化氫酶；與成骨誘導液組比較，aP＜0.05；與P.g LPS+成骨誘導液組比較，bP＜0.05

2.5 白楊黃素對P.g LPS 介導的hPDLSCs 成骨分化的影響 在成骨誘導液作用hPDLSCs 第7、14 天，ALP mRNA 檢測結果顯示，成骨誘導液組ALP 含量顯著高于α-MEM 培養(yǎng)液組（P＜0.05）；與成骨誘導液組比較，P.g LPS+成骨誘導液組ALP mRNA 顯著降低（P＜0.05）。PCR 結果顯示，與α-MEM 培養(yǎng)液組比較，3、7、14 天成骨誘導液組RUNX2、OSX、OCN 和ALP 活性表達水平顯著升高（P 均＜0.05）；P.g LPS+成骨誘導液組RUNX2、OSX、OCN 和ALP 活性表達水平顯著低于成骨誘導液組（P 均＜0.05）。見表6。

表6 P.g LPS 介導hPDLSCs 對成骨分化基因表達水平的影響（±s）

表6 P.g LPS 介導hPDLSCs 對成骨分化基因表達水平的影響（±s）

注：RUNX2 為Runt 相關轉(zhuǎn)錄因子2；OSX 為鋅指結構轉(zhuǎn)錄因子；ALP 為堿性磷酸酯酶；OCN 為骨鈣素；與α-MEM 培養(yǎng)液組比較，aP＜0.05；與成骨誘導液組比較，bP＜0.05

與P.g LPS+成骨誘導液組比較，P.g LPS+成骨誘導液+白楊黃素組RUNX2 和OSX mRNA 表達顯著升高（P 均＜0.05），OCN 和ALP mRNA 表達水平，雖呈現(xiàn)一定的升高趨勢但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表7。

表7 白楊黃素對P.g LPS 介導的hPDLSCs 細胞RUNX2、OSX、OCN、ALP mRNA 表達水平的影響（±s）

表7 白楊黃素對P.g LPS 介導的hPDLSCs 細胞RUNX2、OSX、OCN、ALP mRNA 表達水平的影響（±s）

注：RUNX2 為Runt 相關轉(zhuǎn)錄因子2；OSX 為鋅指結構轉(zhuǎn)錄因子；ALP 為堿性磷酸酯酶；OCN 為骨鈣素；與成骨誘導液組比較，aP＜0.05；與P.g LPS+成骨誘導液組比較，bP＜0.05

3 討論

根尖周炎是口腔中常見的炎癥性骨疾病。研究顯示，根尖周炎發(fā)病過程中牙槽骨的損傷程度與ROS 水平密切相關[10]。ROS 是細胞呼吸代謝過程中產(chǎn)生的一類含有超氧離子化學物的總稱，化學性質(zhì)活潑。在細菌感染過程中，宿主細胞會產(chǎn)生大量ROS，在機體細胞信號傳導、組織代謝以及炎癥性疾病的組織損傷過程中發(fā)揮著關鍵作用[11]。一方面O2-、H2O2和NO 等超氧離子的產(chǎn)生能夠調(diào)控宿主體內(nèi)的免疫細胞識別、消滅病原菌，成為宿主抵抗病原菌感染的關鍵分子；另一方面它們通過直接氧化病損區(qū)正常組織細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA、RNA 及細胞膜內(nèi)的脂質(zhì)成分從而破壞細胞結構、抑制線粒體功能等途徑間接激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，導致細胞凋亡，從而造成病損區(qū)的組織氧化損傷[12]。隨著根尖周炎病程的發(fā)展，效應細胞內(nèi)線粒體功能出現(xiàn)紊亂，導致機體應激性地上調(diào)效應細胞內(nèi)ROS 的水平，對牙周軟硬組織造成嚴重破壞[13-14]。研究表明，患者通過牙周基礎治療有效改善牙周狀況的同時，患者血漿中ROS 水平將會顯著下降[15]，進一步提示ROS 與根尖周炎病損區(qū)的骨組織損傷密切相關。因此，我們推測在根尖周炎疾病的發(fā)生發(fā)展過程中ROS 是重要的炎癥介質(zhì)，有效清除過量的ROS 在根尖周炎的損傷修復中可能發(fā)揮了重要作用。

hPDLSCs 為牙周組織中的成體干細胞，其在外界刺激或疾病狀態(tài)下，通過不斷增殖分化維護牙周組織穩(wěn)態(tài)及骨再生修復。在本研究中，應用P.g LPS處理hPDLSCs，發(fā)現(xiàn)1000ng/mL 的P.g LPS 作用hPDLSCs 72 和96h 后均顯著降低細胞增殖活性；另一方面，隨著作用時間增長，P.g LPS 顯著增加hPDLSCs 的ROS 含量水平，及顯著地降低MnSOD、Cu/ZnSOD、CAT、RUNX2、OSX、OCN 和ALP mRNA表達水平。此外，MnSOD、Cu/ZnSOD 和CAT 被認為是機體清除ROS 的重要調(diào)節(jié)酶[16]。RUNX2 是骨形成的核心基因，是間充質(zhì)干細胞成骨分化的重要指標[17]。OSX 與成骨細胞分化和骨形成相關的特異性轉(zhuǎn)錄因子，只在發(fā)育的骨組織中特異性表達[18]。OCN 為存在于骨組織中豐富的非膠原蛋白，是骨代謝及骨細胞活性的特異性指標，其表達量反映骨形成的速率[19]。ALP 是參與骨等礦化組織代謝以及再生的特異性酶[19]。上述結果表明P.g LPS 作用hPDLSCs 引起ROS的增加，可能是導致hPDLSCs 成骨分化能力降低，促進骨組織損傷的重要原因之一。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，白楊黃素能夠顯著促進成骨細胞系MC3T3-E1 細胞的成骨向分化過程[8]。此外，本實驗結果表明，白楊黃素顯著降低P.g LPS 介導的hPDLSCs 細胞ROS 含量，并增強MnSOD、Cu/ZnSOD 和CAT mRNA 表達水平。同時，白楊黃素對成骨基因RUNX2、OSX、OCN 和ALP 表達具有明顯的促進作用，說明白楊黃素可能通過干預ROS 的產(chǎn)生促進hPDLSCs 的成骨分化潛能，但白楊黃素具體作用機制尚有待進一步實驗驗證。

綜上所述，白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs的ROS 產(chǎn)生具有一定的抑制作用，并且促進hPDLSCs 的成骨分化因子表達水平，從而改善根尖周炎病情。提示白楊黃素可能作為根尖周炎的治療用藥；然而，在炎癥環(huán)境下，其增強hPDLSCs 成骨分化能力具體的分子機制仍有待進一步闡明。