江益娟 謝海燕

高泌乳素血癥是精神疾病患者藥物治療過程中最常見的不良反應(yīng)之一，可能與性腺機(jī)能減退、生殖功能障礙和骨質(zhì)流失有關(guān)，其機(jī)制主要是抗精神病藥與泌乳素細(xì)胞膜上的D2 受體結(jié)合后，阻斷多巴胺對泌乳素合成與釋放的抑制效應(yīng)，使泌乳素的合成與釋放脫抑制，從而導(dǎo)致血清泌乳素水平升高[1]。目前臨床的干預(yù)措施主要有換藥，聯(lián)合使用小劑量的阿立哌唑、溴隱亭等多巴受體激動藥[2]，但多巴胺受體激動劑與抗精神病藥物的作用機(jī)制剛好相反，可導(dǎo)致精神癥狀波動，因此在精神分裂癥患者的使用時需密切關(guān)注其精神癥狀。逍遙丸出自宋朝《太平惠民和劑局方》，研究證實(shí)，逍遙丸能有效降低女性精神分裂癥患者服用抗精神病藥所致的血清高泌乳素水平，且不會影響患者病情的穩(wěn)定，但由于其組方成分復(fù)雜，限制了其使用范圍[3-4]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[5]，通過數(shù)據(jù)挖掘和分析，篩選并預(yù)測逍遙丸活性成分治療HPRL 的潛在靶點(diǎn)和信號通路，以期為高泌乳素血癥的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫、軟件與分析工具 本研究使用的數(shù)據(jù)庫、軟件及分析工具見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫及軟件

1.2 研究方法

1.2.1 逍遙丸組分中7 味中藥的活性成分收集和篩選 通過TCMSP 檢索逍遙丸中柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、甘草和薄荷7 味中藥的相關(guān)化學(xué)成分的ADME[6-7]參數(shù)，利用口服生物利用度（OB）≥30%與類藥性（DL）≥0.18 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[8]，進(jìn)行初步篩選。

1.2.2 逍遙丸作用靶點(diǎn)預(yù)測 從TCMSP 靶點(diǎn)預(yù)測模型預(yù)測逍遙丸組分中7 味中藥活性成分的作用靶點(diǎn)，并利用UniProt 數(shù)據(jù)庫將靶蛋白轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的靶基因。

1.2.3 篩選高泌乳素血癥作用靶點(diǎn) 以“Hyperprolactinemia”為關(guān)鍵詞，通過篩選GeneCards、OMIM、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫中搜尋獲得高泌素血癥的相關(guān)靶點(diǎn)，運(yùn)用R ×64 3.5.3 軟件將高泌乳素血癥的相關(guān)靶點(diǎn)與逍遙丸作用的基因靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，繪制韋恩圖（VennDiagram）。

1.2.4 逍遙丸成分-靶點(diǎn)-高泌乳素血癥網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將從逍遙丸中得到的上述候選化合物、靶點(diǎn)、高泌乳素血癥作為節(jié)點(diǎn)，利用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建相互作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。

1.2.5 蛋白-蛋白相互作用分析（即PPI 網(wǎng)絡(luò)分析）將交集得到的基因?qū)隨TRING 平臺構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為“l(fā)ow connfidence”，其他參數(shù)保持默認(rèn)值，得到逍遙丸治療高泌乳素血癥的體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 基因富集分析 采用DAVID 數(shù)據(jù)庫對逍遙丸治療高泌乳素血癥的靶點(diǎn)基因進(jìn)行基因功能（GO）富集分析，通過R ×64 3.5.3 軟件安裝“Dose”“color-space”“stringi”對其進(jìn)行通路注釋（KEGG）富集分析，對富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化分析，明確其治療高泌乳素血癥的主要藥理學(xué)機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 逍遙丸組分中7 味中藥化學(xué)成分篩選 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫分別搜尋到逍遙丸中的柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、甘草、薄荷7 味中藥的相關(guān)成分1092個，其中滿足OB≥30%的成分共有578 個，滿足DL≥0.18 的成分380 個。根據(jù)ADME 參數(shù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，同時滿足OB≥30%與DL≥0.18 的成分共有156 個。

2.2 逍遙丸與高泌乳素血癥共同靶點(diǎn)預(yù)測 從TCMSP 數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)預(yù)測模型配對分析得到逍遙丸的潛在靶點(diǎn)116 個，從GeneCards、OMIM、PharmGKB數(shù)據(jù)庫中得到高泌乳素血癥的相關(guān)作用靶點(diǎn)198個，將二者進(jìn)行匹配，得到逍遙丸治療高泌乳素血癥的靶點(diǎn)14 個（見表2）；并通過Cytoscape 軟件繪制逍遙丸-靶點(diǎn)-高泌乳素血癥交集圖（見圖1）。圖中綠色節(jié)點(diǎn)代表疾病靶點(diǎn)，紅色節(jié)點(diǎn)代表藥物靶點(diǎn)。

表2 逍遙丸治療高泌乳素血癥靶點(diǎn)信息

圖1 逍遙丸-靶點(diǎn)-高泌乳素血癥交集圖

2.3 逍遙丸-靶點(diǎn)-高泌乳素血癥網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)逍遙丸-靶點(diǎn)-高泌乳素血癥交集靶點(diǎn)信息，利用cytoscape3.8.0 軟件構(gòu)建相互作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型，見圖2。

圖2 逍遙丸與高泌乳素血癥相互作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型

2.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 根據(jù)逍遙丸-靶點(diǎn)-高泌乳素血癥交集靶點(diǎn)信息，通過STRING數(shù)據(jù)庫得到蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（見圖3）。圖3中的每個圓點(diǎn)代表一個蛋白，共有14 個蛋白基因；不同的顏色連線代表不同的定義（黃色-文本挖掘的證據(jù)，黑色-共表達(dá)的證據(jù)，淺藍(lán)-同源性的證據(jù)，紫色-共進(jìn)化的證據(jù)，紅色-基因融合的證據(jù)，綠色-基因連接的證據(jù)）。

圖3 交集基因的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 逍遙丸-靶點(diǎn)-高泌乳素血癥基因功能（GO）富集分析 對逍遙丸治療高泌乳素血癥的14 個靶點(diǎn)基因通過David 數(shù)據(jù)庫生物分子功能注釋系統(tǒng)進(jìn)行基因功能（GO）的富集分析，包括生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF）3 個分支，根據(jù)P＜0.05，篩選得到47 個過程（見圖4）。結(jié)果表明，逍遙丸治療高泌乳素血癥作用的靶點(diǎn)主要富集在對基因表達(dá)的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、乳腺泡發(fā)育、細(xì)胞增殖調(diào)控、肽基絲氨酸磷酸化的正調(diào)控、MAPK 級聯(lián)的正調(diào)控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始、應(yīng)對缺氧、雌二醇刺激的細(xì)胞反應(yīng)、對雌激素的反應(yīng)等31 個生物過程；基底外側(cè)質(zhì)膜、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)域3 個細(xì)胞組成；ATP酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、類固醇激素受體活性、酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、乙酰膽堿結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活因子活性，RNA聚合酶Ⅱ啟動的特異性DNA 結(jié)合等13 個分子功能。

圖4 逍遙丸-靶點(diǎn)-高泌乳素血癥的基因功能（GO）富集分析

3.6 逍遙丸-靶點(diǎn)-高泌乳素血癥通路注釋（KEGG）富集分析 對逍遙丸治療高泌乳素血癥的14 個靶點(diǎn)基因應(yīng)用R×64 4.0.0 軟件進(jìn)行通路注釋（KEGG）富集分析，獲得與高泌乳素血癥相關(guān)的通路有6 條（見圖5）。由圖可知：逍遙丸治療高泌乳素血癥的通路主要富集在EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、癌癥中的蛋白多糖、HIF-1 信號通路、雌激素信號途徑、乳腺癌、膀胱癌通路。

圖5 逍遙丸-靶點(diǎn)-高泌乳素血癥通路（KEGG）富集分析

4 討論

逍遙丸由柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、甘草和薄荷組成，其中柴胡為君藥，疏肝鎮(zhèn)靜、開解郁氣；當(dāng)歸、白芍為臣藥，當(dāng)歸活血補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止痛，白芍柔肝止痛、平抑肝陽、斂陰收汗、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)；白術(shù)、茯苓、甘草、薄荷共為佐藥，白術(shù)補(bǔ)脾益胃和中、燥濕利尿消腫，茯苓健脾滲濕止瀉、養(yǎng)心寧心安神，甘草益氣補(bǔ)脾和胃，薄荷疏散郁遏之氣，諸藥共奏疏肝理氣健脾、益氣養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之功效[9]。臨床上，該方廣泛應(yīng)用于婦女乳腺增生、經(jīng)前期綜合征、月經(jīng)失調(diào)、多囊卵巢綜合征、圍絕經(jīng)期綜合征以及抑郁癥、焦慮癥等多種疾病，臨床療效確切。血泌乳素血癥在中醫(yī)中并無特定病名，因其臨床癥狀多表現(xiàn)為閉經(jīng)、不孕、溢乳、月經(jīng)不調(diào)，故多從月經(jīng)病和溢乳方面探討其病因病機(jī)，主要責(zé)之于肝、脾、腎三臟功能失調(diào)，氣滯、痰濁、肝火及瘀血為患。本研究初步篩選出逍遙丸中黃芩苷、異鼠李素、豆甾醇、白芍苷、白術(shù)內(nèi)脂、茯苓酸等156個活性成分，最后挖掘出逍遙丸治療高泌乳素血癥的14 個關(guān)鍵靶點(diǎn)，并制作出與之相關(guān)聯(lián)的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)圖，提示中藥復(fù)方制劑中的有效成分與以作用靶點(diǎn)的存在著密切關(guān)系，也反映出中醫(yī)藥治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，這與中醫(yī)整體觀念與辨證論治思想不謀而合。

從DAVID 和R 軟件對14 個靶點(diǎn)富集分析結(jié)果可知，逍遙丸主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖調(diào)控、MAPK 級聯(lián)調(diào)控、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、癌癥中的蛋白多糖、HIF-1 信號通路、雌激素信號途徑、乳腺癌等通路來發(fā)揮治療高泌乳素血癥的作用。劉琛等[10-11]研究表明，當(dāng)歸芍藥散可能作用于多巴胺D2 通過cAMPP-PKA 信號通路發(fā)揮治療高泌乳素血癥模型大鼠的作用。張蕓娜等[12]研究顯示，柴郁寄生湯治療高泌乳素血癥對改善卵巢功能有良好療效，其作用機(jī)制可能是調(diào)節(jié)卵巢PRL/PRLR-JAK2/STAT5 信號傳導(dǎo)通路相關(guān)因子的表達(dá)，進(jìn)而改善雌二醇、促卵泡激素等生殖激素水平。陳婧[13]研究顯示，加味逍遙散通過拮抗D1 受體，強(qiáng)化D2 受體的激動作用，一方面對下丘腦多巴胺MAPK-P38MAPK 通路產(chǎn)生影響，改變下丘腦多巴胺的功能水平，通過多條級聯(lián)反應(yīng)鏈的參與，降低血清催乳素水平，另一方面D2 受體效應(yīng)被強(qiáng)化后促進(jìn)了DA 與之結(jié)合，增加催乳素抑制因子（PIF）的分泌而降低PRL 水平；另外，在D1 受體起主要作用時，會產(chǎn)生腎上腺素能副作用，如惡心、嘔吐、頭暈等，而中藥治療高泌乳素血癥的副作用明顯低于溴隱亭，可能也與中藥對D1 受體的拮抗作用更強(qiáng)有關(guān)。以上研究 與本研究結(jié)果相一致，而對于還未探究的通路需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究通過采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的手段，探討逍遙丸治療高泌乳素血癥可能的關(guān)鍵基因和作用分子機(jī)制，為治療高泌乳素血癥提供新的切入點(diǎn)，為進(jìn)一步挖掘其潛在的機(jī)制提供參考。但由于數(shù)據(jù)庫中納入的相關(guān)信息來源于不同的試驗(yàn)條件，且中藥在配伍過程中相互作用可能形成新的成分，故納入分析的成分并不能反映其實(shí)際作用于人體的成分，逍遙丸治療高泌乳素血癥的復(fù)雜機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。