李 潔,何鳳娟,范國華

(1.武漢大學人民醫(yī)院胸外科，湖北 武漢 430061；2.武漢大學人民醫(yī)院乳甲外科，湖北 武漢 430061)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)以彌漫性肺泡損傷、肺通透性增加和富含蛋白質的肺水腫為特征[1]。感染、缺血再灌注損傷和外傷已經被證實是導致ALI最常見的原因。在膿毒癥誘導的ALI中，紊亂的炎癥導致肺泡上皮細胞和內皮細胞損傷甚至死亡，最終可誘發(fā)急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)甚至死亡[2-4]。鐵死亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細胞死亡形式，是一種鐵依賴的以脂質過氧化為主要特征的細胞程序性死亡。轉錄因子紅系2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是一系列抗氧化基因的轉錄因子，具有抑制細胞鐵死亡的作用[5]。既往研究顯示，膿毒血癥可導致肺上皮細胞和內皮細胞的鐵死亡，加重ALI[6]。因此，以激活肺組織Nrf2并降低鐵死亡水平為目標進行干預是預防和治療ALI的重要策略。

右美托咪啶(dexmedetomidine，Dex)是一種高效的α2-腎上腺素受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛雙重作用。既往研究顯示，Dex還具有多種器官保護作用[7]。研究顯示，Dex可通過激活中樞α2-腎上腺素受體減輕膿毒癥相關的炎癥和認知功能障礙[8]。同時，Dex還可通過線粒體自噬減輕七氟醚誘導的神經毒性[9]。此外，Dex預處理可通過激活Nrf2減輕心肌缺血再灌注引起的急性腎損傷和內質網應激[10]。Dex也被報道可通過多種機制發(fā)揮抗ALI的作用，包括抑制炎癥小體激活、維持線粒體動態(tài)平衡、抑制上皮細胞凋亡等[11-12]。但Dex是否可以通過激活Nrf2減輕肺組織鐵死亡目前尚未見文獻報道。本研究擬通過腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)的方式構建小鼠ALI模型,同時觀察Dex干預對小鼠ALI的影響，檢測Dex干預后ALI小鼠肺組織鐵死亡標志物及Nrf2蛋白的水平，以探討Dex對小鼠ALI的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

脂多糖(批號：HY-D1056-100201)、Dex(批號：HY-17034A-15387，純度:98.54%)均購自Medchem Express公司；蘇木素—伊紅(HE)染色試劑盒購自上海歌凡生物科技有限公司)；一抗：GAPDH(批號：ab8245)、胱甘肽過氧化物酶(GPX4，批號：ab125066)、環(huán)氧合酶(COX2，批號：ab179800)、Nrf2(批號：ab62352)、羊抗兔IgG(批號:ab124055)均購自美國Abcam公司。

1.2 實驗動物及模型建立

SPF級雄性C57BL/6小鼠32只，6～8周，體質量225～270 g，由湖北省預防醫(yī)學科學院動物中心提供。將小鼠隨機分為空白對照組(Sham組)、右美托咪啶組(Dex組)、脂多糖組(LPS組)和藥物干預組(LPS+Dex組)。LPS組和LPS+Dex組小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS構建小鼠ALI模型[13]；Dex組及LPS+Dex組小鼠腹腔注射Dex(40 μg/kg)；Sham組和LPS組注射等劑量生理鹽水[6]。12 h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速分離小鼠左肺與右肺，并將其分別置于10%中性福爾馬林溶液和-80 ℃凍存。

1.3 HE染色

左肺樣本在10%中性福爾馬林溶液中固定7 d后，用石蠟包埋并切片。將肺組織石蠟切片于60 ℃下烤片后，于二甲苯和梯度酒精中脫蠟并水化。蘇木素染細胞核，伊紅染細胞質，脫水封片后在光學顯微鏡下觀察各組肺組織的形態(tài)。小鼠肺損傷程度依據(jù)肺水腫、炎癥細胞浸潤、出血、肺不張和透明膜的形成等5項指標分別進行評分：0分，肺血管、肺泡、間質及支氣管均正常；1分，病變范圍小于整個視野面積；2分，病變范圍為整個視野面積的25%～50%；3分，病變范圍為整個視野面積的50%～75%；4分，病變范圍大于整個視野面積的75%。

1.4 qRT-PCR檢測相關促炎基因的表達

使用RNeasyMini Kit試劑盒提取小鼠右肺組織中總RNA，通過紫外分光光度法檢測總RNA樣本濃度和純度，并通過反轉錄合成cDNA。將各樣本的cDNA分別配制好實時定量PCR體系，并于實時定量PCR儀進行擴增。以GAPDH為內參基因對各樣本目的基因進行校正。各基因qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 Western blot檢測相關蛋白的表達

提取各組小鼠右肺組織總蛋白，隨后將其于80～120 V電壓下進行SDS-PAGE電泳。100 min后，將凝膠中的蛋白進行轉膜1.5 h，隨后分別用抗GPX4(1∶500)、COX2(1∶200)、Nrf2(1∶500)及GAPDH(1∶1 000)的一抗在4 ℃下孵育過夜。次日，用二抗(羊抗兔)稀釋液(1∶5 000)于室溫避光孵育50 min。孵育結束后，使用Odyssey掃膜儀對各蛋白條帶進行掃描并定量，以GAPDH作為內參蛋白對各樣本目的蛋白進行校正。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織HE染色結果對比

與Sham組相比，LPS組小鼠肺組織出現(xiàn)了明顯的病理學損傷，表現(xiàn)為肺水腫，肺泡腔炎癥細胞和紅細胞浸潤，其肺損傷評分明顯升高(4.21±0.43vs.1.09±0.54，P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Dex組小鼠肺損傷明顯減輕且肺損傷評分明顯降低(2.11±0.36vs.4.21±0.43，P<0.05)，見圖1。

*：與Sham組比較,P<0.05；#：與LPS組比較,P<0.05

2.2 各組小鼠肺組織促炎性細胞因子mRNA表達比較

與Sham組相比，LPS組小鼠肺組織中促炎性細胞因子，包括IL-1β、TNF-α、IL-6和MCP-1 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Dex組小鼠肺組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 和MCP-1 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，見表2，表明Dex可減輕ALI小鼠肺組織炎癥反應。

表2 各組小鼠肺組織促炎性細胞因子mRNA表達比較

2.3 各組小鼠肺組織鐵死亡水平比較

Western blot結果顯示，與Sham組相比，LPS組小鼠肺組織中GPX4的蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，而COX2的蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Dex組小鼠肺組織中GPX4蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而COX2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖2，表明Dex可抑制ALI小鼠肺組織鐵死亡。

*：與Sham組比較,P<0.05；#：與LPS組比較,P<0.05

2.4 各組小鼠肺組織Nrf2蛋白的表達

Western blot結果顯示，與Sham組相比，LPS組小鼠肺組織中Nrf2的蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Dex組小鼠肺組織中Nrf2的蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，見圖3。

*：與Sham組比較,P<0.05；#：與LPS組比較,P<0.05

3 討論

肺是哺乳動物與外界環(huán)境直接接觸的最大上皮表面，是氣體交換的主要器官。同時，肺也是機體重要的免疫器官，肺組織中存在一定量的免疫細胞，一旦受到外界刺激可誘導免疫反應[14-15]。由于與外界環(huán)境的直接接觸，肺也更容易受到外界病原體和毒害物質的攻擊，易發(fā)生ALI甚至ARDS。ALI是機體對嚴重肺部微生物感染的反應，是免疫識別病原體引起的促炎免疫反應的結果。ALI可引起局部或全身不可逆的損傷，造成富含蛋白質的液體靜力性肺水腫、難治性低氧血癥、呼吸困難，甚至死亡[16]。本研究結果顯示，LPS(10 mg/kg)注射12 h可誘發(fā)明顯的小鼠肺損傷和炎癥反應；同時，LPS組小鼠肺組織中鐵死亡水平較Sham組小鼠明顯升高，表明LPS可誘發(fā)小鼠肺組織的鐵死亡。而40 μg/kg Dex可明顯減輕小鼠肺損傷和炎癥反應，同時降低小鼠肺組織鐵死亡水平；且Dex可明顯上調小鼠肺組織中Nrf2的蛋白表達，因此，我們推測Dex發(fā)揮肺保護作用及抑制鐵死亡的作用可能與Nrf2的激活有關。

Nrf2是一種細胞抗氧化反應的關鍵調節(jié)因子，可調控抗氧化和親電應激的基因表達。許多疾病的發(fā)生與細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的失衡有關，說明抗氧化防御系統(tǒng)在防止與活性氧自由基(reactive oxide species，ROS)積累相關的疾病中發(fā)揮重要作用[5]。近年來，越來越多的研究證實，脂質過氧化產物是誘發(fā)實體器官損傷的重要驅動因素[17-18]。鐵死亡是一種鐵依賴的脂質過氧化驅動的新型細胞死亡方式[19]。Nrf2已經被證實可通過多種機制抑制鐵死亡，包括調控鐵代謝基因、中間代謝基因及谷胱甘肽合成相關基因。研究表明，Nrf2激活可通過抑制肺上皮細胞鐵死亡減輕LPS及缺血再灌注誘導的小鼠ALI[5]。GPX4可在谷胱甘肽的輔助下通過催化作用去除細胞內脂質過氧化，減輕細胞鐵死亡。GPX4的抑制或敲除可使細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，發(fā)生鐵死亡。COX2是炎癥反應重要的誘導酶，同時也是鐵死亡重要且敏感的標志蛋白之一[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激可明顯抑制小鼠肺組織中Nrf2和谷胱甘肽過氧化物酶GPX4表達，同時促進肺組織中COX2的表達。

Dex是一種脂溶性α2-腎上腺素受體激動劑，1999年首次作為鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物應用于臨床[7]。由于Dex對呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)的抑制作用較弱，其目前主要被用于重癥監(jiān)護病房患者的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛，以及圍術期的麻醉輔助。研究發(fā)現(xiàn)，Dex可改善限制性肺疾病和肥胖患者的肺氧合功能[20]。Dex也可以通過抑制NLRP3炎癥小體的激活來緩解LPS誘導的ALI[21]。此外，Dex還可通過HIF-1α/HO-1信號通路維持線粒體動態(tài)平衡以改善ALI[6]。不同于上述研究，本研究首次發(fā)現(xiàn)Dex預處理可明顯上調Nrf2和GPX4的表達，同時抑制COX2的表達，表明Dex可能通過激活Nrf2減輕LPS誘導的肺組織鐵死亡，最終發(fā)揮肺保護作用。

綜上所述，本研究首次揭示了Dex減輕膿毒癥肺損傷的新機制——通過激活Nrf2抑制肺組織鐵死亡，這可為今后臨床ALI的預防和治療提供一定的參考。