王雨榕， 鄧 強， 李中鋒， 彭冉東， 李軍杰， 喬小萬

(1.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730030)

骨質(zhì)疏松癥是老年性人群常見的疾病之一，嚴重影響老年人群的生活質(zhì)量，近年來研究發(fā)現(xiàn)，中藥及復方制劑在治療骨質(zhì)疏松癥上有獨特的優(yōu)勢，具有良好的防治作用。目前，關于骨質(zhì)疏松癥的基礎研究已深入到分子生物學層面，但對于中醫(yī)藥相關作用機制仍缺乏報道。由于人類脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生比較復雜，因此造模方法也多種多樣[1-2]，本研究探討溫腎強骨丸防治脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥大鼠的作用機制，以期為相關臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD大鼠60只，雌性，體質(zhì)量(200±20)g，購自甘肅中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(甘)2015-0005，倫理審查號2019-035，喂養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心(SPF級)，給予普通大鼠顆粒飼料和高壓滅菌的自來水，環(huán)境溫度控制在4～18 ℃。光照、暗室時間均為7：00～19：00,相對濕度控制在45%～65%。

1.2 試劑與藥物 氫化可的松注射液(紫光古漢集團衡陽制藥有限公司，國藥準字H43021210)；溫腎強骨丸(甘肅省中醫(yī)院，批號20180926)；阿侖膦酸鈉(杭州默沙東制藥有限公司，國藥準字J20130085)。番瀉葉(甘肅省中醫(yī)院中藥藥房)，制備為水煎液。水合氯醛(天津市大茂化學試劑廠，批號20181006)；4%多聚甲醛溶液(武漢賽維爾生物科技有限公司，批號XS190201)；甘藍、精煉豬油自備；蒸餾水、生理鹽水、苦味酸均由甘肅中醫(yī)藥大學實驗中心提供。

1.3 儀器 雙能X線骨密度檢測儀(美國GE公司)；AG-X系列臺式電子萬能試驗機(日本島津公司)；硬組織切片機(德國Leica公司)。

1.4 方法

1.4.1 造模 大鼠適應飼養(yǎng)后，隨機分為正常組、假手術組、模型組、西藥組及溫腎強骨丸高、中、低劑量組，除正常組外，其余各組大鼠參照文獻[3-4]報道的去勢(切除雌性大鼠雙側(cè)卵巢)+注射氫化可的松+番瀉葉灌胃+飲食失節(jié)+勞倦過度法進行造模。大鼠禁食12 h后腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)，剔除兩側(cè)腹部皮毛，75%酒精消毒，在雙側(cè)肋下1～1.5 cm處縱向切開入腹，結(jié)扎雙側(cè)卵巢動脈，切除雙側(cè)卵巢及周圍脂肪，逐層縫合[5]；假手術組只暴露雙側(cè)卵巢，不做切除，去勢術后第2天每天上午9時用番瀉葉水煎液灌胃，每只2 mL，正常組、假手術組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，下午3時將大鼠置于38 ℃恒溫水浴中游泳至疲勞(疲勞標準為全身下沉至沒頸，不能堅持游泳)，每只單日喂飼甘藍10 g，雙日喂飼精煉豬脂2 mL，正常組、假手術組大鼠予普通飼料，其間各組大鼠均自由飲水[6]，術后1周開始肌肉注射氫化可的松注射液(2 mL/10 mg)5 mg/kg，假手術組大鼠肌注等量生理鹽水，每周4次。通過一般活動，包括活動度、毛發(fā)、爪甲顏色、大便質(zhì)地、飲食、飲水量等來評價脾腎陽虛證造模是否成功，骨密度、骨生物力學及椎體HE染色來評價骨質(zhì)疏松癥造模是否成功。

1.4.2 給藥 溫腎強骨丸高、中、低劑量組大鼠給藥劑量分別為1.72、0.86、0.43 g/kg，每天1次；正常組、模型對照組大鼠以等劑量生理鹽水灌胃；西藥組按人鼠等效劑量灌胃給予阿侖膦酸鈉，每周1次，每次6 mg/kg，持續(xù)8周。

1.5 指標檢測

1.5.1 一般狀態(tài) 包括大鼠形態(tài)、毛發(fā)色澤、爪甲顏色、活動度、飲食情況、糞便形態(tài)及次數(shù)。造模結(jié)束后，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取左側(cè)股骨，剔除肌肉、筋膜等組織，生理鹽水紗布塊包裹，于-20 ℃冰箱中保存；取第5腰椎，剔除肌肉組織，于4%多聚甲醛溶液中保存。

1.5.2 骨密度 將大鼠麻醉后置于雙能X線骨密度儀下，檢測股骨、脊柱骨密度[7]。應用萬能材料試驗機進行股骨三點彎曲試驗，將凍存的大鼠左股骨自然解凍后置于AG-IS生物力學萬能試驗機上，設定跨距15 mm,加載速度10 mm/min,計算機記錄載荷變形曲線及最大載荷、彈性模量、斷裂點載荷[8-9]。將第5腰椎用10%EDTA溶液中脫鈣石蠟包埋，切片脫蠟后用蘇木精和伊紅(HE)染色，然后在光學顯微鏡下觀察拍照[10-12]。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài) 在造模第6～8周，模型組大鼠出現(xiàn)了便溏、掉毛、喜扎堆、尾巴涼等脾腎陽虛癥狀，說明造模成功；溫腎強骨丸干預后第4～6周，與模型組比較，溫腎強骨丸組大鼠上述癥狀改善。

2.2 骨密度 與正常組比較，模型組大鼠股骨與脊柱骨密度均降低(P<0.05)，說明造模成功；假手術組大鼠骨密度略有下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組比較，溫腎強骨丸組、西藥組大鼠股骨、脊柱骨密度均升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠股骨、脊柱骨密度比較

2.3 股骨三點彎曲骨生物力學 與正常組比較，模型組大鼠彈性模量、最大載荷、斷裂點載荷均下降(P<0.05)，說明造模成功；與模型組比較，溫腎強骨丸高劑量組、西藥組大鼠彈性模量、最大載荷值、斷裂點載荷升高(P<0.05)，而中、低劑量組彈性模量也升高(P<0.05)，但最大載荷值、斷裂點載荷無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠股骨生物力學指標比較

2.4 椎體HE染色 正常組大鼠椎體骨組織呈粉紅色，椎體內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為骨小梁；與正常組比較，模型組大鼠骨小梁密度減少、變窄，骨小梁間距增加；與模型組比較，溫腎強骨丸高劑量組大鼠骨小梁密度增加，骨小梁間距增寬，見圖1。

圖1 各組大鼠椎體HE染色(×200)

3 討論

溫腎強骨丸為甘肅省中醫(yī)院脊柱骨二科經(jīng)驗方藥，由淫羊藿、骨碎補、枸杞子和丹參等7味中藥組成，具有溫腎強骨、活血通絡之功效，經(jīng)多年臨床運用，治療脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥取得良好效果，因此，本實驗基于臨床療效觀察，來研究它對脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥大鼠的防治作用，為臨床廣泛運用溫腎強骨丸提供實驗依據(jù)。

采取去勢(切除大鼠卵巢)+注射氫化可的松+番瀉葉灌胃+飲食失節(jié)+勞倦過度方法聯(lián)合造脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，將病癥相結(jié)合，更好模擬人類的發(fā)病機制。實驗結(jié)果顯示，溫腎強骨丸干預后能改善脾腎陽虛型大鼠的一般狀況，說明溫腎強骨丸能緩解脾腎陽虛型癥狀。模型組大鼠下肢及椎體骨量的流失，骨密度及骨生物力學均出現(xiàn)下降，并用溫腎強骨丸干預后，高劑量組骨密度及骨生物力學也增高，大鼠骨質(zhì)改善。大鼠一般狀態(tài)及活動的觀察，可與人類脾腎陽虛癥狀相對應。大鼠出現(xiàn)的癥狀與人類脾腎陽虛的臨床表現(xiàn)一致，則證明造模成功。通過骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機制的研究，發(fā)現(xiàn)骨密度、骨生物力學及骨病理學觀察等均可反應骨組織的生長狀況[13-15]。將上述實驗室指標作為判斷大鼠骨質(zhì)疏松癥造模成功和干預結(jié)果的標準。HE染色可以直觀的反映出骨小梁的形態(tài)及間隔的變化，是骨組織形態(tài)學研究最重要的方法，能更好的反映大鼠骨質(zhì)疏松程度。實驗結(jié)果顯示溫腎強骨丸高劑量增加了椎體骨組織中骨小梁的厚度、增加了骨小梁之間的間距，使骨組織中骨小梁數(shù)量增加，改善骨組織質(zhì)量。

目前對于中醫(yī)證候的評價標準仍未統(tǒng)一，未來需要進一步進行實驗驗證[16-18]。本實驗采取復合多種造模方法，但干擾因素較多，需進一步簡化造模方法，以期制備更適合的動物模型。本研究通過動物實驗證實了溫腎強骨丸能明確改善脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松大鼠的脾腎陽虛癥狀、骨密度以及骨生物力學，這表明它對脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松有一定的防治作用，但是其藥動學仍需進一步研究，并且其作用機制不明確，未來可基于骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的信號通路進一步深入研究它對骨代謝影響的作用機制，為將來溫腎強骨丸的廣泛臨床應用提供研究基礎，推動中藥靶向治療和個體化治療的發(fā)展。