高昌琨， 高玉菊， 張 楠， 胡 蝶

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥化學(xué)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230022；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230061)

馬兜鈴為馬兜鈴科植物北馬兜鈴或馬兜鈴的干燥成熟果實(shí)，前者主要分布在東北、華北等地，后者分布于河南、山東及江南地區(qū)，其主要成分為馬兜鈴酸類。自1993年以來，陸續(xù)有馬兜鈴酸導(dǎo)致終末期腎病(ESRD) 及上尿路上皮癌(UUC) 等嚴(yán)重不良反應(yīng)的報(bào)道[1-3]，對(duì)藥材中馬兜鈴酸類成分進(jìn)行嚴(yán)格的含量控制對(duì)于相關(guān)藥材和復(fù)方的質(zhì)量安全尤為重要。

馬兜鈴酸為硝基菲類羧酸化合物，主要有馬兜鈴酸A、B、C、D[4-6]，文獻(xiàn)已有對(duì)以上4種成分同時(shí)進(jìn)行含量監(jiān)控的報(bào)道[7-9]，或者檢測(cè)馬兜鈴總酸的含量[10-12]。馬兜鈴內(nèi)酰胺為馬兜鈴酸在人體內(nèi)的代謝物，可以和DNA結(jié)合形成難以降解的加合物，持續(xù)損害人腎小管，因此也具有和馬兜鈴酸相似的腎臟毒性[13-16]。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-TOF/MS首次對(duì)馬兜鈴中5種毒性成分同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定，從馬兜鈴酸類和內(nèi)酰胺類兩大類毒性成分更全面評(píng)價(jià)馬兜鈴相關(guān)藥材的毒性，以期為其合理安全使用提供數(shù)據(jù)支撐。

此外，馬兜鈴種子和果皮中馬兜鈴酸類成分含量差異較大[11]，本實(shí)驗(yàn)通過收集多批馬兜鈴主產(chǎn)地藥材，通過分別測(cè)定果皮和種子中相應(yīng)5種成分的含量及加合量，探討馬兜鈴藥材區(qū)分用藥部位(以果皮入藥)入藥的可能性。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260系列高效液相色譜、Agilent 6520四級(jí)桿飛行時(shí)間(Q-TOF)質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；KQ2200B 超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；BT25S電子天平(德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Milli-Q純水器(美國(guó)Millpore公司)。

1.2 試劑與藥物 藥材信息見表1，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)金傳山教授鑒定為北馬兜鈴AristolochiacontortaBge. 或馬兜鈴AristolochiadebilisSieb. et Zucc.的干燥成熟果實(shí)，區(qū)分為果皮和種子部位。對(duì)照品馬兜鈴酸A、B、C、D及馬兜鈴內(nèi)酰胺均購(gòu)于上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，純度大于98%。乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；甲酸(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為Millpore Milli-Q超純水。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 對(duì)照品溶液 稱取5種對(duì)照品適量，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，即得貯備液，混合并稀釋成25、6.25、1.5、0.8、0.4、0.2、0.05 μg/mL的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 稱取馬兜鈴果皮1 g,加入80%甲醇-0.1%甲酸10 mL,超聲提取2次，每次30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用水稀釋4倍。HPD-100樹脂小柱(3 mL)先用5 mL甲醇活化，再用5 mL水平衡。馬兜鈴提取液以3 mL/min體積流量上樣，先用5 mL水洗脫除雜，再用5 mL 80%甲醇洗脫，收集80%甲醇洗脫流分，N2吹干，80%甲醇-0.1%甲酸反溶，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件 Zorbax C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)；流動(dòng)相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)；梯度洗脫(0～2 min，5%B；3～14 min，5%～95%B；14～14.5 min，95%～5%B；14.5～17 min，5%B；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量3 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 ESI離子源；正離子模式檢測(cè)；噴嘴電壓500 V；霧化氣壓力35 psi(1 psi=6.895 kPa);氮?dú)怏w積流量8 L/min; 干燥氣溫度300 ℃；鞘氣體積流量10 L/min; 鞘氣溫度300 ℃。定量離子見表2。數(shù)據(jù)分析采用 Agilent MassHunter Qualitative Analysis軟件(Version B.04.00)。

表2 5種成分定量離子(正離子模式)

2.2.3 系統(tǒng)適用性考察 精密吸取對(duì)照品、供試品適量，在“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1，可知5種成分與相鄰峰得到很好地分離。

1.馬兜鈴酸C 2.馬兜鈴酸D 3.馬兜鈴酸B 4.馬兜鈴內(nèi)酰胺 5.馬兜鈴酸A

2.2.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣3 μL分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下0.8 μg/mL對(duì)照品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣4次，連續(xù)測(cè)定3 d，測(cè)得馬兜鈴酸A、B、C、D及馬兜鈴內(nèi)酰胺日內(nèi)精密度RSD分別為1.87%、10.00%、3.43%、3.92%、3.64%，日間精密度RSD分別為7.21%、16.12%、7.33%、7.36%、17.43%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)條件下于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得馬兜鈴酸A、B、C、D及馬兜鈴內(nèi)酰胺峰面積RSD分別為5.29%、14.03%、6.96%、9.69%、12.75%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材粉末6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得馬兜鈴酸A、B、C、D及馬兜鈴內(nèi)酰胺含量RSD分別為4.43%、13.23%、6.98%、5.08%、7.62%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知(1號(hào))的種子粉末6份，每份約0.5 g, 精密加入適量對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 樣品含量測(cè)定 取各藥材適量，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，結(jié)果見表5。由此可知，14批藥材中果皮所含5種成分平均總含量為(2.86±1.03)μg/g，而種子為(156.23±58.31)μg/g，兩者相差約50倍。

表5 各成分含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

馬兜鈴，尤其是種子中含有較多的脂肪，需要對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理凈化后才能采用質(zhì)譜進(jìn)行分析。一般預(yù)處理方法多采用C18SPE 小柱，但價(jià)格較為昂貴且容易堵塞萃取柱，而采用價(jià)廉易得的HPD-100樹脂作為預(yù)處理凈化方法，可以達(dá)到類似的效果并可反復(fù)使用，節(jié)約分析檢測(cè)成本。

本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)譜提取離子(EIC)方式進(jìn)行定量，其中文獻(xiàn)[7]報(bào)道馬兜鈴酸類成分的一級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)多種加合離子，如馬兜鈴酸A包括m/z705.1[2 M+Na]+、m/z364.1[2 M+Na]+、m/z298.1[M+H-CO2]+，以及較弱的m/z342.1[M+H]+, 加合離子較多不利于取得更高的靈敏度，優(yōu)化質(zhì)譜條件后，馬兜鈴酸A產(chǎn)生較強(qiáng)及相對(duì)單一的m/z364.1[2 M+Na]+，因此，選擇該離子作為定量離子。

文獻(xiàn)報(bào)道，不同產(chǎn)地的馬兜鈴藥材中馬兜鈴酸A的含量差異巨大，在460.73～1 039.46 μg/g之間；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)馬兜鈴果皮和種子中不但5種成分差異明顯，其總含量更是相差約50倍之多(果皮小于種子)，實(shí)際應(yīng)用中種子取樣量小更容易導(dǎo)致取樣不均，更加增大了安全用藥風(fēng)險(xiǎn)。2020年版《中國(guó)藥典》由于馬兜鈴的毒性已刪去該品種，但保留含有馬兜鈴的復(fù)方品種31項(xiàng)，為進(jìn)一步降低使用馬兜鈴復(fù)方的風(fēng)險(xiǎn)，建議馬兜鈴藥材區(qū)分用藥部位(以果皮入藥)入藥。