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        HPLC法同時測定五指柑中9種成分

        2021-10-26 12:56:26戚建中沈冰冰符國成唐湘黔龔小兵
        中成藥 2021年10期
        關(guān)鍵詞:牡荊草素醛酸

        陳 丹, 戚建中, 李 柯, 沈冰冰, 符國成, 唐湘黔, 龔小兵

        [1.湖南省中醫(yī)藥研究院,湖南 長沙 410013;2.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南 湘潭 411102;3.華潤三九(郴州)制藥有限公司,湖南 郴州 423000]

        五指柑為馬鞭草科植物黃荊VitexnegundoLinnaeus 的干燥全草,收載于湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(2009版)和廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第三冊(2019),功效解表清熱、利濕除痰、止咳平喘[1-2],所含的咖啡??崴犷惡忘S酮類成分具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、止咳平喘、保肝等活性??Х弱?崴犷惤Y(jié)構(gòu)相似,同分異構(gòu)化合物較多,現(xiàn)有文獻(xiàn)定量指標(biāo)少,只對個別黃酮或總黃酮化合物進(jìn)行測定,大多采用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取,未對有機(jī)酸建立定量分析方法[3-5]。目前,以五指柑作為主要原料組成的多個成方制劑都是以水煎液用藥,故水提液中所含成分才是其臨床主要有效物質(zhì)[6-9]。本實驗以對照藥材及不同產(chǎn)地的五指柑為對象,建立了HPLC法同時測定水提液中黃酮類及有機(jī)酸類9種成分的含量,該方法穩(wěn)定可靠,重復(fù)性好,可為五指柑藥材及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料

        1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測器(日本島津公司);XPE105電子分析天平(十萬分之一,瑞士Mettler-Toledo公司);HX-06超聲波清洗器(武漢恒信世紀(jì)科技有限公司)。

        1.2 試劑與藥物 綠原酸(批號110753-201716,純度99.3%)、咖啡酸(批號110885-200102,純度100%)對照品購自中國食品藥品檢定研究院;異葒草苷(批號DST180717-121,純度99%)、葒草苷(批號DST170717-049,純度99%)、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷(批號DST180715-067,純度98%)對照品購自成都德思特生物技術(shù)有限公司;異牡荊素(批號Yz102220,純度98%)對照品購自南京源植生物科技有限公司;木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷(批號PRF10022043,純度98%)對照品購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;新綠原酸(批號MUST-18031001,純度99.67%)、隱綠原酸(批號MUST-18032403,純度99.07%)對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司。乙腈為色譜純(購自美國Tedia公司);磷酸為色譜純,甲醇為分析純(長沙市匯虹化玻儀器設(shè)備有限公司);水為怡寶純凈水。五指柑對照藥材(批號121496-201502)購自中國食品藥品檢定研究院;10批五指柑原藥材(WZG)均為產(chǎn)地收集(2018年7~8月),經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院李若存研究員鑒定為馬鞭草科植物黃荊VitexnegundoLinnaeus 的干燥全草,具體信息見表1。

        表1 樣品信息

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件 月旭ultimate C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相乙腈(A)-0.5%磷酸(B),梯度洗脫,程序見表2;檢測波長340 nm;柱溫30 ℃;體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。在該色譜條件下,理論板數(shù)以各色譜峰計均不少于4 000。

        表2 梯度洗脫程序

        2.2 溶液制備

        2.2.1 對照品溶液 精密稱取9種對照品,加50%甲醇制成每1 mL分別含新綠原酸0.104 1 mg、綠原酸0.114 8 mg、隱綠原酸0.124 0 mg、咖啡酸0.101 6 mg、異葒草苷0.465 6 mg、葒草苷0.217 8 mg、異牡荊素0.228 2 mg、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷0.179 2 mg、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷1.019 2 mg的貯備液。

        分別精密量取上述貯備液1 mL,置10 mL量瓶中,加50%甲醇制成每1 mL分別含新綠原酸10.41 μg、綠原酸11.48 μg、隱綠原酸12.40 μg、咖啡酸10.16 μg、異葒草苷46.56 μg、葒草苷21.78 μg、異牡荊素22.82 μg、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷17.92 μg、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷101.92 μg的對照品溶液。

        2.2.2 供試品溶液 取原藥材粉末(批號180401)約2.0 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,加30 mL水加熱回流30 min,濾過,藥渣再加20 mL水加熱回流20 min,濾過,合并2次濾液,蒸干,殘渣用60%甲醇溶解并定容至10 mL,0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

        2.2.3 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品、空白溶液各10 μL,在“2.1”項色譜條件下測定,色譜圖見圖1。

        1.新綠原酸 2.綠原酸 3.隱綠原酸 4.咖啡酸 5.異葒草苷 6.葒草苷 7.異牡荊素 8.木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷 9.木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷

        2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項下貯備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL,按質(zhì)量濃度由低至高的次序加至6個10 mL量瓶中,50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,分別精密吸取10 μL,在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸,結(jié)果見表3,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        2.4 精密度試驗 取對照品溶液,在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷峰面積RSD分別為1.23%、1.19%、1.48%、0.91%、0.93%、0.62%、0.83%、1.36%、1.27%,表明儀器精密度良好。

        2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(批號180401),于0、4、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定,測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷峰面積RSD分別為0.23%、0.89%、1.32%、0.34%、1.25%、0.74%、0.68%、1.51%、1.64%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.6 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(批號180401)適量,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份,在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣,測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷含量RSD分別為1.50%、1.59%、1.43%、1.21%、1.63%、1.65%、1.87%、1.54%、1.48%,表明該方法重復(fù)性良好。

        2.7 加樣回收率試驗 精密稱取同一批各成分含量已知的樣品(批號180401)6份,分別加入與供試品溶液中9種成分含量比例約為1∶1的對照品,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣,計算回收率。結(jié)果,新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷平均加樣回收率分別為97.70%、98.39%、97.94%、98.05%、97.80%、97.72%、98.01%、97.21%、97.99%,RSD分別為1.25%、1.90%、2.10%、1.98%、1.70%、1.78%、1.47%、1.67%、1.32%。

        2.8 樣品含量測定 取10批樣品,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定,計算含量,結(jié)果見表4。

        表4 各成分含量測定結(jié)果(mg/g)

        3 討論

        五指柑含黃酮和酚酸,均是抗炎、抗病毒的重要成分[2-4]。有文獻(xiàn)報道,以單一黃酮類成分作為五指柑的質(zhì)控指標(biāo)[4];本研究對五指柑中9種成分進(jìn)行測定,結(jié)果不同產(chǎn)地含量差異顯著,可能由于產(chǎn)地、加工方法等導(dǎo)致其內(nèi)在質(zhì)量出現(xiàn)差異,因此對五指柑多種成分同時測定可更全面反映其內(nèi)在質(zhì)量。課題組前期對五指柑進(jìn)行薄層分析及含量測定[10],結(jié)合9種成分的性質(zhì)及用藥習(xí)慣,確定供試品溶液的制備方法為水加熱回流提取2次。

        取一定質(zhì)量濃度的9種對照品溶液進(jìn)行光譜掃描,結(jié)果有機(jī)酸類成分最大吸收波長為327 nm,葒草苷、異葒草苷、異牡荊素最大吸收波長為340 nm,木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷最大吸收波長為348 nm,基本符合文獻(xiàn)[有機(jī)酸類成分為(327±2)nm[11],葒草苷、異葒草苷、異牡荊素為330、340或350 nm[12-15],木犀草素類成分為340或350 nm[16]]。本實驗分別在330、340、350 nm波長處對9種成分進(jìn)行測定,結(jié)果各波長對其含量、色譜峰數(shù)量均無明顯影響,即330~350 nm均可。再比較了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%磷酸流動相,發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.5%磷酸梯度洗脫時9種成分均能達(dá)到基線分離。

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