陳 丹， 戚建中， 李 柯， 沈冰冰， 符國成， 唐湘黔， 龔小兵

[1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013；2.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102；3.華潤三九(郴州)制藥有限公司，湖南 郴州 423000]

五指柑為馬鞭草科植物黃荊VitexnegundoLinnaeus 的干燥全草，收載于湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(2009版)和廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第三冊(2019)，功效解表清熱、利濕除痰、止咳平喘[1-2]，所含的咖啡酰奎尼酸類和黃酮類成分具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、止咳平喘、保肝等活性?？Х弱？崴犷惤Y(jié)構(gòu)相似，同分異構(gòu)化合物較多，現(xiàn)有文獻(xiàn)定量指標(biāo)少，只對個(gè)別黃酮或總黃酮化合物進(jìn)行測定，大多采用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，未對有機(jī)酸建立定量分析方法[3-5]。目前，以五指柑作為主要原料組成的多個(gè)成方制劑都是以水煎液用藥，故水提液中所含成分才是其臨床主要有效物質(zhì)[6-9]。本實(shí)驗(yàn)以對照藥材及不同產(chǎn)地的五指柑為對象，建立了HPLC法同時(shí)測定水提液中黃酮類及有機(jī)酸類9種成分的含量，該方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，可為五指柑藥材及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-20A紫外檢測器(日本島津公司)；XPE105電子分析天平(十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；HX-06超聲波清洗器(武漢恒信世紀(jì)科技有限公司)。

1.2 試劑與藥物 綠原酸(批號110753-201716，純度99.3%)、咖啡酸(批號110885-200102，純度100%)對照品購自中國食品藥品檢定研究院；異葒草苷(批號DST180717-121，純度99%)、葒草苷(批號DST170717-049，純度99%)、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷(批號DST180715-067，純度98%)對照品購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；異牡荊素(批號Yz102220，純度98%)對照品購自南京源植生物科技有限公司；木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷(批號PRF10022043，純度98%)對照品購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；新綠原酸(批號MUST-18031001，純度99.67%)、隱綠原酸(批號MUST-18032403，純度99.07%)對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司。乙腈為色譜純(購自美國Tedia公司)；磷酸為色譜純，甲醇為分析純(長沙市匯虹化玻儀器設(shè)備有限公司)；水為怡寶純凈水。五指柑對照藥材(批號121496-201502)購自中國食品藥品檢定研究院；10批五指柑原藥材(WZG)均為產(chǎn)地收集(2018年7～8月)，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院李若存研究員鑒定為馬鞭草科植物黃荊VitexnegundoLinnaeus 的干燥全草，具體信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 月旭ultimate C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.5%磷酸(B)，梯度洗脫，程序見表2；檢測波長340 nm；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。在該色譜條件下，理論板數(shù)以各色譜峰計(jì)均不少于4 000。

表2 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取9種對照品，加50%甲醇制成每1 mL分別含新綠原酸0.104 1 mg、綠原酸0.114 8 mg、隱綠原酸0.124 0 mg、咖啡酸0.101 6 mg、異葒草苷0.465 6 mg、葒草苷0.217 8 mg、異牡荊素0.228 2 mg、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷0.179 2 mg、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷1.019 2 mg的貯備液。

分別精密量取上述貯備液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL分別含新綠原酸10.41 μg、綠原酸11.48 μg、隱綠原酸12.40 μg、咖啡酸10.16 μg、異葒草苷46.56 μg、葒草苷21.78 μg、異牡荊素22.82 μg、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷17.92 μg、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷101.92 μg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取原藥材粉末(批號180401)約2.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加30 mL水加熱回流30 min，濾過，藥渣再加20 mL水加熱回流20 min，濾過，合并2次濾液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解并定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品、供試品、空白溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，色譜圖見圖1。

1.新綠原酸 2.綠原酸 3.隱綠原酸 4.咖啡酸 5.異葒草苷 6.葒草苷 7.異牡荊素 8.木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷 9.木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下貯備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL，按質(zhì)量濃度由低至高的次序加至6個(gè)10 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷峰面積RSD分別為1.23%、1.19%、1.48%、0.91%、0.93%、0.62%、0.83%、1.36%、1.27%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號180401)，于0、4、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷峰面積RSD分別為0.23%、0.89%、1.32%、0.34%、1.25%、0.74%、0.68%、1.51%、1.64%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號180401)適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷含量RSD分別為1.50%、1.59%、1.43%、1.21%、1.63%、1.65%、1.87%、1.54%、1.48%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批各成分含量已知的樣品(批號180401)6份，分別加入與供試品溶液中9種成分含量比例約為1∶1的對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率。結(jié)果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷平均加樣回收率分別為97.70%、98.39%、97.94%、98.05%、97.80%、97.72%、98.01%、97.21%、97.99%，RSD分別為1.25%、1.90%、2.10%、1.98%、1.70%、1.78%、1.47%、1.67%、1.32%。

2.8 樣品含量測定 取10批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含量測定結(jié)果(mg/g)

3 討論

五指柑含黃酮和酚酸，均是抗炎、抗病毒的重要成分[2-4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，以單一黃酮類成分作為五指柑的質(zhì)控指標(biāo)[4]；本研究對五指柑中9種成分進(jìn)行測定，結(jié)果不同產(chǎn)地含量差異顯著，可能由于產(chǎn)地、加工方法等導(dǎo)致其內(nèi)在質(zhì)量出現(xiàn)差異，因此對五指柑多種成分同時(shí)測定可更全面反映其內(nèi)在質(zhì)量。課題組前期對五指柑進(jìn)行薄層分析及含量測定[10]，結(jié)合9種成分的性質(zhì)及用藥習(xí)慣，確定供試品溶液的制備方法為水加熱回流提取2次。

取一定質(zhì)量濃度的9種對照品溶液進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果有機(jī)酸類成分最大吸收波長為327 nm，葒草苷、異葒草苷、異牡荊素最大吸收波長為340 nm，木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷最大吸收波長為348 nm，基本符合文獻(xiàn)[有機(jī)酸類成分為(327±2)nm[11]，葒草苷、異葒草苷、異牡荊素為330、340或350 nm[12-15]，木犀草素類成分為340或350 nm[16]]。本實(shí)驗(yàn)分別在330、340、350 nm波長處對9種成分進(jìn)行測定，結(jié)果各波長對其含量、色譜峰數(shù)量均無明顯影響，即330～350 nm均可。再比較了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%磷酸流動相，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.5%磷酸梯度洗脫時(shí)9種成分均能達(dá)到基線分離。