李思媛， 崔玉順， 李新星， 何 佳， 唐紅珍， 楊世林， 高紅偉*

(1.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧 530200；2.廣西優(yōu)勢中成藥與民族藥開發(fā)工程技術中心，廣西 南寧 530020)

炎癥是對入侵病原體，受損細胞和刺激物的自我保護反應[1]，實質(zhì)上也是指機體與致炎因子進行斗爭的反應，在整個炎癥過程中這種斗爭反映會一直存在于機體各部分組織和器官，常見的有扁桃體炎、肺炎、肝炎、腎炎等，過度的炎癥反應對人體產(chǎn)生損傷，嚴重的會導致中風、風濕性關節(jié)炎、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等[2]。炎癥根據(jù)其性質(zhì)可分為急性和慢性，當機體受到外來刺激時首先會產(chǎn)生急性炎癥，伴隨著等離子和粒細胞從血液運輸?shù)搅耸軗p組織，然后血管和免疫系統(tǒng)對受損組織作出免疫應答，進一步開始釋放炎癥介質(zhì)，從而誘發(fā)急性炎癥進入慢性期[1]。因此，關于炎癥作用機制的研究對其引起相關疾病的治療具有重要的指導意義。

黃精化學成分包括皂苷、多糖、黃酮、生物堿等，目前對多糖的研究最廣泛[3]，但鮮有涉及皂苷。以往研究顯示，其他植物皂苷都具有抗炎、抗腫瘤、抗真菌等作用[4-5]，其中從黃精中分離出的甾體皂苷可抑制脂多糖誘導的RAW264.7細胞分泌NO、TNF-α，具有一定的抗炎作用，但該成分對炎癥反應作用的確切藥理機制尚未見報道。因此，本實驗以RAW264.7細胞為對象，研究黃精皂苷通過NF-κB/MAPKs信號通路發(fā)揮體外抗炎作用及其機制。

1 材料

1.1 藥材 黃精購于廣西臨山殿中草藥種植有限公司，經(jīng)蘇州大學李笑然教授鑒定為正品。取粗粉100 g，1 L甲醇浸提18 h后于30～40 ℃下超聲1 h，濾過，濾液濃縮至無醇味，加入適量純水混懸，乙酸乙酯萃取，濃縮萃取液，除去溶劑，即得黃精提取物，黃精皂苷質(zhì)量分數(shù)為84%。

1.2 細胞與試劑 小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7購于中國科學院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)基(2327860)、胎牛血清(2176404)、PBS(2200918)購自美國Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒(TE266615)購自美國Thermo公司；GAPDH(8884S)、NF-κB/p65(8242S)、iNOS(2977S)、COX-2(4842S)、IKKα(2682S)、IKKβ(8943S)、IκBα(4814S)、p-IKKα/β(2697S)、p-IκBα(2859S)、P-NF-κB/p65(3033S)、p38(9212S)、ERK(4370S)、JNK(9252S)、p-p38(4511S)、p-ERK(4370S)、p-JNK(4668S)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(100918190307)購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠TNF-α(M200115-102a)、IL-6(M210125-004a)ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；ROS試劑盒(1630212)購自美國Sigma-Aldrich公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及貯存液配制 RAW264.7細胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 d傳代1次。黃精皂苷浸膏溶于DMSO配制成20 mg/mL貯存液，避光-20 ℃保存，實驗時用含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應濃度(DMSO終體積分數(shù)不超過0.1%)。

2.2 MTT比色法檢測細胞活性 將RAW264.7細胞按照每孔5×104個的密度接種于96孔板中過夜培養(yǎng)，待細胞貼壁后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入用1%培養(yǎng)基配制好的不同質(zhì)量濃度黃精皂苷(20、40、80、100 μg/mL)藥液，培養(yǎng)細胞24 h，加入MTT工作液，避光于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，每孔加入DMSO 100 μL，室溫避光，于搖床上搖晃溶解結(jié)晶，多功能微孔板檢測儀在570 nm波長處測定光密度(OD)值。細胞存活率=(OD給藥組/OD空白組)×100%

2.3 LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子檢測 RAW264.7細胞以每孔5×104個的密度接種于96孔板中過夜培養(yǎng)，將細胞分為空白組、模型組、給藥組，給藥組用不同質(zhì)量濃度黃精皂苷預處理細胞1 h，LPS誘導炎癥模型。

2.3.1 上清培養(yǎng)液NO水平 模型組和給藥組給予LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)刺激18 h。各組吸取50 μL上清培養(yǎng)液至96孔細胞培養(yǎng)板中，加入50 μL Griess試劑，輕輕搖晃使其充分混勻，在37 ℃下放置反應30 min后，多功能微孔板檢測儀在540 nm波長處測定光密度。

2.3.2 上清培養(yǎng)液TNF-α、IL-6水平 模型組和給藥組給予LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)刺激18 h，取上清培養(yǎng)液，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測黃精皂苷對TNF-α、IL-6釋放的影響。

2.4 JC-1熒光染色法檢測胞內(nèi)線粒體膜電位(MMP)水平 LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)誘導8 h，棄去孔中液體，加入含JC-1染色液的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，孵育完成后加入100 μL冰PBS洗滌細胞，棄去液體后每孔加入100 μL PBS，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.5 活性氧(ROS)釋放檢測

2.5.1 流式細胞儀 將RAW264.7細胞以每孔1.5×105個的密度接種于24孔板過夜培養(yǎng)，將細胞分為空白組、模型組、給藥組，給藥組用黃精皂苷(20、40、80 μg/mL)預處理1 h后，LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)誘導8 h，將ROS探針DCFH2-DA(10 μg/mL)加入96孔板中，在37 ℃下避光孵育30 min，冰PBS清洗細胞1次，加入冰胰酶進行消化后加入300 μL冰PBS將細胞沖洗下來，收集到流式管中，上機檢測。

水稻紋枯病俗稱“爛腳病”“花腳桿”，苗期至穗期都可發(fā)病。濕度低時葉鞘中部組織破壞呈半透明狀，邊緣暗褐，發(fā)病嚴重時病斑融合形成大病斑，呈不規(guī)則狀云紋斑，致葉片發(fā)黃枯死。葉片上的病斑呈云紋狀，邊緣褪黃，發(fā)病快時病斑呈污綠色，葉片很快腐爛。莖稈受害癥狀似葉片，后期呈黃褐色，易折。穗頸部受害常不能抽穗，抽穗的秕谷較多，千粒重下降。高溫條件下病斑上產(chǎn)生一層白色粉霉層，即病菌的擔子和擔孢子［3］。

2.5.2 ROS試劑盒 RAW264.7細胞以每孔5×104個的密度接種于96孔板中過夜培養(yǎng)，將細胞分為空白組、模型組、給藥組，給藥組用黃精皂苷(20、40、80 μg/mL)預處理細胞1 h，LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)誘導8 h，誘導完成后棄去上清液，按照ROS檢測試劑盒操作步驟進行ROS檢測。

2.6 Western Blot法檢測炎癥相關蛋白表達 RAW264.7細胞以每孔6×105個的密度接種于6孔板過夜培養(yǎng)，將細胞分為空白組、模型組、給藥組，給藥組用黃精皂苷(20、40、80 μg/mL)預處理1 h后，LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)分別誘導8、24 h，從培養(yǎng)箱中取出細胞置于冰上，棄掉培養(yǎng)基，預冷的PBS緩沖液洗滌2次，加入適量蛋白裂解液，裂解10 min后細胞刮將其刮下來收集于1.5 mL EP管，4 ℃、15 000 r/min離心15 min，取上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，酶標儀于562 nm波長處檢測其光密度，蛋白樣品中加入5×SDS-PAGE Loading buffer，于97 ℃金屬浴中煮沸7 min使蛋白變性，10%SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)于PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h后，分別使用iNOS、COX-2、IKKα、IKKβ、p-IKKα/β、IκBα、p-IκBα，NF-κB/p65、p-p65、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、GAPDH的抗體(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，二抗在室溫下孵育2 h，TBST洗滌3次，化學發(fā)光法顯影。

3 結(jié)果

3.1 黃精皂苷對RAW264.7細胞活性的影響 RAW264.7細胞用黃精皂苷藥液處理24 h后，存活率沒有受到抑制，說明黃精皂苷(20、40、80 μg/mL)對RAW264.7細胞不具有毒性，見圖1。

注：與空白組比較，#P<0.05。

3.2 黃精皂苷對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放NO的影響 由圖2可知，與空白組比較，模型組NO水平增加(P<0.01)；與模型組比較，黃精皂苷3個劑量組NO水平減少(P<0.01)，表明黃精皂苷對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放NO具有抑制作用。

注：與空白組比較，##P<0.01；與LPS組比較，**P<0.01。

3.3 黃精皂苷對LPS誘導的RAW264.7細胞中IL-6、TNF-α釋放的影響 圖3表明，與空白組比較，模型組IL-6、TNF-α釋放增多(P<0.01)；與模型組比較，黃精皂苷40、80 μg/mL組IL-6釋放減少(P<0.05、P<0.01)，80 μg/mL組TNF-α釋放減少(P<0.05)，說明黃精皂苷對LPS誘導的RAW264.7細胞中IL-6、TNF-α釋放具有抑制作用。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與LPS組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.4 黃精皂苷對細胞線粒體膜電位(MMP)的影響 如圖4所示，與空白組比較，模型組中LPS破壞了線粒體膜電位的穩(wěn)定性，JC-1單體(綠色熒光)增加；黃精皂苷預處理后，JC-1單體降低，聚合體(紅色熒光)增加，表明黃精皂苷可維持線粒體膜電位的穩(wěn)定。

圖4 MMP顯微熒光圖(×10)

3.5 黃精皂苷對LPS誘導的ROS產(chǎn)生的影響 如圖5所示，模型組ROS生成增加(P<0.01)；與模型組比較，黃精皂苷80 μg/mL組ROS產(chǎn)生減少(P<0.05)。ROS試劑盒檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組ROS生成增加(P<0.05)；與模型組比較，黃精皂苷3個劑量組ROS產(chǎn)生有所減少(P<0.05)，表明黃精皂苷對LPS誘導RAW264.7細胞產(chǎn)生的ROS具有抑制作用。

注：A為ROS流式細胞儀檢測結(jié)果，B為 ROS試劑盒檢測結(jié)果。與空白組比較，##P<0.01；與LPS組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.6 黃精皂苷對LPS誘導的RAW264.7細胞中iNOS、COX-2表達的影響 如圖6所示，與空白組比較，模型組iNOS、COX-2的表達增加(P<0.01)；與模型組比較，給藥組iNOS、COX-2表達減少(P<0.01)，表明黃精皂苷對兩者表達具有抑制作用。

注：A為iNOS及COX-2蛋白表達圖，B～C為iNOS及COX-2蛋白相對表達量統(tǒng)計柱狀圖。與空白組比較，##P<0.01；與LPS組比較，**P<0.01。

3.7 黃精皂苷對LPS誘導的RAW264.7細胞中NF-κB信號通路的影響 如圖7所示，1 μg/mL LPS作用于RAW264.7細胞8 h后，NF-κB p65磷酸化蛋白(p-p65)、IKKα/β磷酸化蛋白(p-IKKα/β)、IκBα磷酸化蛋白(p-IκBα)表達提高(P<0.01)；與模型組比較，不同質(zhì)量濃度黃精皂苷均可以降低磷酸化蛋白的表達(P<0.01)，說明黃精皂苷能在一定程度上降低RAW264.7細胞炎癥模型中NF-κB信號通路磷酸化蛋白的表達，而且在不同劑量下對IκBα總蛋白的降解具有抑制作用。

注： A為NF-κB信號通路蛋白表達圖，B～D為p-IKKα/β、p-IκBα、p-p65蛋白相對表達量統(tǒng)計柱狀圖。與空白組比較，##P<0.01；與LPS組比較，**P<0.01。

3.8 黃精皂苷對LPS誘導的RAW264.7細胞中MAPK信號通路的影響 如圖8所示，1 μg/mL LPS作用于RAW264.7細胞8 h后，ERK磷酸化蛋白(p-ERK)、JNK磷酸化蛋白(p-JNK)、p38磷酸化蛋白(p-p38)的表達提高(P<0.01)；與模型組比較，不同質(zhì)量濃度的黃精皂苷均可以降低磷酸化蛋白的表達(P<0.01)，說明黃精皂苷能在一定程度上降低RAW264.7炎癥細胞模型中MAPK信號通路磷酸化蛋白的表達，從而發(fā)揮抗炎作用。

注：A為MAPK信號通路蛋白表達圖，B～D為p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白相對表達量統(tǒng)計柱狀圖。與空白組比較，##P<0.01；與LPS組比較，**P<0.01。

4 討論

小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7是其機體抗炎免疫以及防御的主要成員[6]，在炎癥過程中會分泌炎癥相關細胞因子，參與炎癥反應[7]，常用于細胞生物學研究。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細菌外膜主要成分之一，多用于建立炎癥模型[8-10]。LPS可以促使很多細胞模型大量釋放炎癥介質(zhì)及因子如NO,PGE2,IL-6,IL-1β和TNF-α等[10]，特別是對于巨噬細胞模型。一氧化氮是一種與多種免疫病理變化相關的反應性自由基。經(jīng)LPS刺激，RAW264.7細胞中的iNOS過度表達，導致一氧化氮大量產(chǎn)生，從而觸發(fā)多重炎癥病理反應。COX-2是COX同工酶中的一種，是介導炎癥的關鍵酶[1]。過度分泌的細胞因子IL-6和TNF-α是重要的炎癥介質(zhì)[11-12]。黃精皂苷抑制LPS誘導的iNOS、COX-2表達，以及亞硝酸鹽，IL-6的產(chǎn)生，其高濃度對TNF-α的釋放具有抑制作用。LPS刺激巨噬細胞之后，其產(chǎn)生的活性氧(ROS)顯著增高，線粒體的膜電位也明顯降低[13]。過多的ROS產(chǎn)生可能會通過降低線粒體膜電位從而損傷線粒體，而黃精皂苷對ROS生成有抑制作用，對MMP的降低有抑制作用，結(jié)果表明其對線粒體具有一定的保護作用。

NF-κB是該家族的核轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞對細胞因子等各種外界刺激的響應，在細胞的炎癥及免疫應答等過程中起到關鍵性作用[1,14-17]。NF-κB通過IKK刺激IκB從而被激活。激活的p65從細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細胞核，與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合[18]，導致一連串促炎性靶因子轉(zhuǎn)錄，其中包括IL-6，TNF-α，iNOS等。黃精皂苷對LPS誘導的磷酸化的IKKα/β、IκBα和p65蛋白表達有抑制作用，這表明NF-κB通路可能是它的抗炎作用機制之一。MAPKs通路調(diào)控從增殖分化到細胞凋亡等多種過程[19-20]，也積極參與免疫防御和炎癥反應，該通路主要有ERK、p38和JNK三條途徑[21]，特別是p38途徑，是炎性介質(zhì)合成的主要途徑之一，因此被認為是抗炎藥物的重要靶點。在LPS刺激的蛋白中，黃精皂苷對磷酸化的p38MAPK和JNK、ERK蛋白表達也具有抑制作用，這表明它們也可能參與了黃精皂苷的抗炎作用。

綜上所述，黃精皂苷可以抑制LPS刺激的RAW264.7細胞產(chǎn)生的炎癥，其作用機制可能與抑制NF-κB、MAPKs信號通路有關，更深入的機制及作用有效成分的確認，還有待進一步研究發(fā)現(xiàn)。