梁 潔 廖安全 葉昌榮 吳婉倩

廣東省河源市人民醫(yī)院腎內(nèi)風(fēng)濕免疫科，廣東河源 517000

有關(guān)數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示，慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患病率為10.8%，CKD的患病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。目前，終末期CKD患者主要以血液透析、腹膜透析及腎移植為腎臟替代治療方式，雖然能改善患者癥狀，但是遠(yuǎn)期預(yù)后較差，給患者及其家庭帶來心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。既往研究表明：在健康人群的胃腸道內(nèi)寄居著多種微生物[2]，包括對(duì)身體有益的微生物群（革蘭氏陽(yáng)性菌、雙歧桿菌等）、潛在的致病菌（銅綠假單胞菌、大腸桿菌等），這些微生物在人體腸道內(nèi)處于共生狀態(tài)，保持著一種動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)，發(fā)揮代謝、營(yíng)養(yǎng)及增強(qiáng)免疫力的作用，能促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育，維持正常的免疫功能。然而，當(dāng)該平衡被打破后，將會(huì)增加胃腸道疾病的發(fā)生率[3-4]。同時(shí)，持續(xù)的腸道菌群異常會(huì)引起系統(tǒng)炎癥，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。臨床上對(duì)于兩者的關(guān)系缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。因此，本研究以CKD非透析患者及健康體檢者為對(duì)象，探討CKD患者腸道菌群特征及與微炎癥因子水平的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年7月至2020年6月河源市人民醫(yī)院腎內(nèi)風(fēng)濕免疫科收治的35例CKD非透析患者為研究對(duì)象，設(shè)為觀察組，女15例，男20例，年齡41～78歲，平均（56.95±5.61）歲；體質(zhì) 量 指 數(shù)（body mass index，BMI）18 ～ 27 kg/m2，平均（23.26±3.25） kg/m2；病 程 1～ 7個(gè) 月，平 均（3.69±0.72）個(gè)月；有飲酒史12例，有吸煙史8例；選擇38名同期健康體檢者設(shè)為對(duì)照組，女16例，男22例，年齡40～77歲，平均（57.11±5.65）歲；BMI 17 ～ 28 kg/m2，平均（23.31±3.27） kg/m2；體檢人群中，有飲酒史11例，有吸煙史12例。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《改善全球腎臟病預(yù)后組織指南》[7]中CKD診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者腎小球?yàn)V過率（glomerular filtration rate，GFR）＜ 30 ml/（min·1.73m3）；②均完成腸道微生物及微炎癥因子測(cè)定，且患者均可耐受；③具有完整的一般資料與隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并精神異常、消化系統(tǒng)疾病或治療史者；②妊娠期、哺乳期或嚴(yán)重心、肝功能異常者；③近期服用抗生素、益生菌等影響腸道菌群藥物者；④行腎臟替代治療（包括血透、腹透、腎移植）者。

1.3 研究方法

（1）腸道菌群測(cè)定。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定兩組糞便中長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌、糞腸球菌及大腸桿菌，具體方法如下：①標(biāo)本采集及總DNA的提取。所有患者入院后均使用無菌采樣盒收集患者24 h內(nèi)糞便標(biāo)本，并將其放置于糞菌DNA提取液中。根據(jù)E.Z.N.A.R soil試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20184915）說明書完成總DNA的提取，采用NanoDrop2000完成DNA濃度與純度測(cè)定。前述操作完畢后采用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳完成DNA提取質(zhì)量的檢測(cè)[8]。②對(duì)采集的糞便標(biāo)本采用PCR法（南京伊若達(dá)儀器設(shè)備有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20193815）檢測(cè)糞便中雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌、糞腸球菌及大腸桿菌的mRNA表達(dá)，設(shè)定PCR參數(shù)，30℃下操作10 min、42℃處理 30 min、99℃下處理 5 min、5℃下處理5 min，合計(jì)完成35個(gè)循環(huán)，最終10 min延長(zhǎng)，溫度72℃。將最終獲得的產(chǎn)物置于濃度為1.5%瓊脂凝膠電泳，且測(cè)定完畢后采用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比[9-10]。（2）炎癥因子測(cè)定。兩組患者入院后次日清晨取外周空腹血 3 ml，4500 r ，35 min 離心，分離出的血清采用免疫比濁法測(cè)定兩組C反應(yīng)蛋白（c-reactive protein，CRP）水平；采用ELISA法測(cè)定兩組白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，試劑盒均購(gòu)于美國(guó)R&D systems公司，生產(chǎn)批號(hào)：20191836[11-12]。參考值：CRP參考值＜5 mg/L；TNF-α參考值：0.10～2.31 ng/L；IL-6參考值：0～8 ng/L；（3）相關(guān)性分析。采用Pearson軟件對(duì)CKD患者腸道菌群特征與微炎癥因子水平進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 觀察指標(biāo)

①腸道菌群結(jié)果。記錄兩組雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌、糞腸球菌及大腸桿菌結(jié)果；②炎性因子。記錄兩組CRP、IL-6、TNF-α水平；③相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件處理分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，采用（）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者腸道菌群結(jié)果比較

觀察組CKD患者雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；糞腸球菌及大腸桿菌均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組腸道菌群結(jié)果比較（，lgCFU/g）

表1 兩組腸道菌群結(jié)果比較（，lgCFU/g）

組別 n 雙歧桿菌 嗜酸乳酸桿菌 糞腸球菌 大腸桿菌觀察組 35 6.37±1.12 5.53±0.89 7.41±0.798.95±1.12對(duì)照組 38 10.49±1.51 6.78±0.95 6.32±0.677.12±0.83 t值 7.416 6.092 6.778 9.135 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組患者炎性因子比較

觀察組CKD患者炎性因子CRP、IL-6及TNF-α水平均高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者炎性因子比較（）

表2 兩組患者炎性因子比較（）

組別 n CRP（mg/L） IL-6（ng/L） TNF-α（ng/L）觀察組 35 7.34±0.71 153.69±21.59 285.34±25.62對(duì)照組 38 2.32±0.43 72.45±6.71 114.29±18.43 t值 6.392 8.991 6.031 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 CKD患者腸道菌群特征與微炎癥因子水平相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，CKD患者中炎性因子CRP、IL-6及TNF-α水平與雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），與糞腸球菌及大腸桿菌數(shù)量呈正相關(guān)性（P＜0.05）。見表3。

表3 CKD患者腸道菌群特征與微炎癥因子水平相關(guān)性

3 討論

既往研究表明[13-14]：CKD與腸道菌群存在緊密的聯(lián)系，具有相互影響作用。CKD患者腸道菌群的數(shù)量與構(gòu)成與正常人相比發(fā)生一定變化，腸道菌群紊亂亦可影響CKD患者病情，且菌群產(chǎn)生的分子為尿毒癥毒素的重要組成部分。因此，加強(qiáng)CKD患者腸道菌群測(cè)定，能夠了解患者微生態(tài)失衡的機(jī)制，指導(dǎo)臨床治療，避免腸道菌群失調(diào)，為CKD診療提供新途徑[15]。本研究中，觀察組CKD患者雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌水平低于對(duì)照組（P＜0.05）；糞腸球菌及大腸桿菌均高于對(duì)照組（P＜0.05），提示CKD患者常伴有腸道菌群紊亂，主要表現(xiàn)為有害菌的增多及有益菌的減少。通過對(duì)腸道微生物進(jìn)行細(xì)致的研究及定量分析，能夠增加對(duì)于CKD發(fā)生的理解。既往研究表明正常人群腸道內(nèi)菌群維持相對(duì)平衡，但是CKD患者將會(huì)引起腸道菌群失衡。本研究中，觀察組CKD患者炎性因子CRP、IL-6及TNF-α水平均高于對(duì)照組，提示CKD患者常伴有炎癥因子的高表達(dá)，主要是由于CKD患者發(fā)病后炎癥在多種因素作用下，引起單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)激活，造成機(jī)體處于微炎癥狀態(tài)。同時(shí)，患者發(fā)病后機(jī)體內(nèi)的代謝廢物隨著腎臟清除能力的下降而在體內(nèi)蓄積，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥因子，持續(xù)的炎癥因子亦可增加CKD發(fā)生率[16]。為了進(jìn)一步分析CKD患者腸道菌群與炎癥因子的關(guān)系，本研究結(jié)果顯示：CKD患者中炎性因子CRP、IL-6及TNF-α水平與雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)性，與糞腸球菌及大腸桿菌數(shù)量呈正相關(guān)性，提示CKD患者腸道菌群與微炎癥狀態(tài)有關(guān)，加強(qiáng)患者腸道菌群測(cè)定能夠指導(dǎo)臨床治療。但是，本研究亦存在諸多局限性，如納入病例數(shù)較少，需要加大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，CKD患者常伴有腸道菌群紊亂，且與微炎癥因子水平存在相關(guān)性，期待能夠?yàn)榕R床治療提供更多參考。