李 君 李 見 王世信

1.棗莊市立第四醫(yī)院內(nèi)一科，山東棗莊 277599；2.徐州市中心醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州 221009

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的重要并發(fā)癥之一，已成為發(fā)達國家終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）的首要危險因素[1]。透析治療是目前ESRD主要的治療方式，但透析治療容易并發(fā)心血管意外、血管相關(guān)意外、感染等并發(fā)癥，增加ESRD的死亡率[2]。ESRD的發(fā)病機制和安全有效的治療方案有待進一步研究。DN是ESRD發(fā)病的獨立危險因素[3]。有證據(jù)表明，炎性反應(yīng)參與DN的病理過程，DN發(fā)病與TLR-4/NFκB信號通路密切相關(guān)[4]。但DN發(fā)展為ESRD的具體機制尚未完全明確。目前，基因組學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍逐漸擴大，以基因組學(xué)為基礎(chǔ)的生物信息學(xué)方法可短時間內(nèi)獲取并分析海量的基因表達數(shù)據(jù)，深入挖掘疾病的潛在機制和核心通路[5]。本研究利用生物信息學(xué)方法挖掘DN發(fā)展為ESRD的潛在機制和核心靶點，為ESRD的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 DN和ESRD差異表達基因篩選

在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中檢索獲取芯片數(shù)據(jù)。下載GSE142153數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含7例ESRD患者、23例DN患者、10例健康對照對象的外周血單個核細胞的基因表達數(shù)據(jù)。利用R語言軟件中的“l(fā)imma”和“pheatmap”對 GSE142153數(shù)據(jù)集進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以P＜0.05、|fold change|≥2為條件進行差異表達基因篩選和聚類分析，并將結(jié)果可視化。

1.2 DN和ESRD共同差異表達基因篩選

將DN和ESRD差異表達基因?qū)肷镄畔W(xué)與進化基因組學(xué)網(wǎng)站的韋恩圖繪制模塊，分別將上調(diào)和下調(diào)的DN和ESRD差異表達基因取交集，即可獲得DN和ESRD共同差異表達基因，即DN發(fā)展為ESRD的潛在靶基因，繪制韋恩圖。

1.3 潛在靶基因富集分析

以P＜0.05為條件，利用R語言“ClusterProfiler”數(shù)據(jù)包對篩選得到的潛在靶基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路和基因本體（gene oncology，GO）富集分析，并將富集結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 DN差異表達基因篩選

經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理和篩選，與正常對照組相比，DN組樣本存在160個差異基因，其中上調(diào)基因100個，下調(diào)基因60個；ESRD組樣本存在74個差異基因，其中上調(diào)基因37個，下調(diào)基因37個。經(jīng)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和聚類分析，繪制數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后差異基因表達火山圖和熱圖，見圖1。

圖1 使用Fold change和校正后P值繪制火山圖和熱圖

2.2 DN和ESRD共同差異表達基因篩選

將上調(diào)和下調(diào)的DN和ESRD差異表達基因分別取交集，獲得DN和ESRD共同上調(diào)差異表達基因12個，下調(diào)差異表達基因10個，即DN發(fā)展為ESRD的潛在靶基因，繪制韋恩圖，見表1及圖2。

表1 DN和ESRD共同差異表達基因

圖2 DN和ESRD差異表達基因韋恩圖

2.3 潛在靶基因富集分析

富集分析結(jié)果表明，上調(diào)的潛在靶基因顯著富集于氮素代謝信號通路；涉及蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能、血紅蛋白復(fù)合物等細胞組分和紅細胞分化等生物學(xué)過程。下調(diào)的潛在靶基因未得到相關(guān)富集結(jié)果，表明DN發(fā)展為ESRD的過程中，差異基因以上調(diào)表達為主，見圖3。

圖3 潛在靶基因富集分析

3 討論

DN是最常見的慢性腎臟疾病，也是ESRD的主要原因[6]。DN被認為是血流動力學(xué)和代謝因素相互作用的結(jié)果，其發(fā)病機制涉及多因素、多途徑，其中炎癥起主要作用[7]。此外，氧化應(yīng)激反應(yīng)也是加重DN患者腎損傷的重要因素，可加快DN向ESRD進展的速度[8]。有學(xué)者認為，血、尿腎損傷分子（kidney injury molecule，KIM）1水平可能成為DN進展的生物標(biāo)志物[9]，也有研究指出，TNF受體超家族成員與ESRD的發(fā)病密切相關(guān)[10]。但DN向ESRD進展的潛在機制尚未完全明確。ESRD嚴重影響患者的生活質(zhì)量[11]，明確ESRD的發(fā)病機制，探索其發(fā)病的關(guān)鍵靶點，對提高ESRD療效、改善患者的生活質(zhì)量意義重大。

本研究利用生物信息學(xué)方法挖掘發(fā)現(xiàn)，DN發(fā)展為ESRD的過程中，差異基因以上調(diào)表達為主，上調(diào)的潛在靶基因顯著富集于氮素代謝信號通路；涉及蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能、血紅蛋白復(fù)合物等細胞組分和紅細胞分化等生物學(xué)過程。

氮的代謝水平與腎病關(guān)系密切，研究表明，當(dāng)合并急性腎損傷時，患者腎小球濾過能力顯著降低，含氮以及非含氮代謝產(chǎn)物發(fā)生蓄積，患者死亡率增加[12]。與腎病相關(guān)的非蛋白氮代謝產(chǎn)物分別有血清肌酐、尿素氮、尿酸等，也是腎功能的重要指標(biāo)[13]。研究表明，腸道菌群與慢性腎臟病關(guān)系密切，腸道菌群可以通過促進含氮廢物的排除等途徑，減輕腎衰竭模型動物的腎損傷程度[14]。

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶是一種細胞分泌酶，主要存在于腎臟、胰腺、肝臟等組織器官中。研究證實，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶與慢性腎臟病的進展程度密切相關(guān)，可以作為慢性腎臟病進展的獨立預(yù)測因素[15]。韓國一項納入600余萬例的研究表明，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶可以作為ESRD進展的預(yù)測因子[16]。

鐵參與人體的多種生理過程，包括氧的運輸、酶的活性和能量的代謝等。鐵穩(wěn)態(tài)失衡與多種病理過程有關(guān)，鐵穩(wěn)態(tài)的紊亂和鐵介導(dǎo)的細胞毒性與腎臟損傷互為因果[17]。腎臟通過尿液的重吸收過程參與全身鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，腎臟中鐵的蓄積和尿中鐵濃度的增加與各種腎臟疾病和腎損傷的病理過程相關(guān)[18]。鐵在紅細胞生成和血紅蛋白的合成過程中發(fā)揮重要作用，這使得紅細胞的生成過程消耗了體內(nèi)絕大部分鐵，也是體內(nèi)鐵代謝的重要途徑。紅細胞生成過程中，赤鐵酮表達增多，可以抑制鐵調(diào)素的表達，調(diào)劑體內(nèi)鐵的平衡[19]。血紅蛋白復(fù)合物等細胞組分和紅細胞分化等生物學(xué)過程可能會通過介導(dǎo)鐵的代謝發(fā)揮干預(yù)終末期腎病的病理過程。

綜上所述，DN發(fā)展為ESRD的過程中，差異基因以上調(diào)表達為主，上調(diào)的潛在靶基因顯著富集于氮素代謝信號通路；涉及蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能、血紅蛋白復(fù)合物等細胞組分和紅細胞分化等生物學(xué)過程。本研究挖掘獲取的差異基因均來自DN、ESRD和健康人的外周血液樣本的測序結(jié)果，但由于樣品標(biāo)準(zhǔn)化和富集分析過程中可能存在的主觀因素影響，研究結(jié)果可能存在偏差，挖掘得到的核心靶點和信號通路在DN發(fā)展為ESRD過程中的機制有待進一步實驗驗證。