薛 娟 馬文斌 涂 華 劉 康 成永之 連增林▲

1.北京金康和信藥業(yè)科技有限公司，北京 100176；2.連云港金康和信藥業(yè)有限公司，江蘇連云港 222000

補(bǔ)充葉酸（folic acid，F(xiàn)A）能夠降低神經(jīng)管畸形及腦卒中的發(fā)病率，有助于多種疾病的治療[1-2]，葉酸還原酶將非活性的葉酸代謝形成的5-甲基四氫葉酸等活性葉酸激活，5-亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸的關(guān)鍵代謝酶[3-4]，然而，有26.4%的中國人因?yàn)榇嬖谠撁傅幕蛭稽c(diǎn)突變，不能將葉酸轉(zhuǎn)化為活性的5-甲基四氫葉酸，無法發(fā)揮其治療作用，有人群應(yīng)用的局限性[5]。

6S-5-甲基四氫葉酸鈣（商品名：葉源酸?）是一種創(chuàng)新型5-甲基四氫葉酸的鈣鹽，它能夠克服葉酸還原酶點(diǎn)突變所致的葉酸活性轉(zhuǎn)化的限制，適用于各種人群。目前，該專利產(chǎn)品作為葉酸新來源已經(jīng)被允許用于調(diào)制乳粉和固體飲料[6]。但是，至今國內(nèi)外對其研究多集中在合成方法、含量檢測、穩(wěn)定性等方面[7-8]，尚未對其功能展開深入研究，為探討其潛在的醫(yī)療保健價(jià)值，本研究探討6S-5-甲基四氫葉酸鈣對機(jī)體免疫力的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

6S-5-甲基四氫葉酸鈣[9]（連云港金康和信公司，批號 20141209，發(fā)明專利號：ZL201410280541.4）為類白色結(jié)晶粉末，實(shí)驗(yàn)以飲用純凈水為溶媒，分別配制成低 0.8 mg/（kg·d）、中 1.7 mg/（kg·d）、高5.0 mg/（kg·d）三個(gè)劑量，分別相當(dāng)于人推薦量的5、10、30倍；SPF級ICR小鼠購自上海西普爾-必凱公司[SCXK（滬）2013-0016]，雄性，體重16～20 g，動(dòng)物質(zhì)量合格證號為2008001646720，實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

樣品液配制方法：取6S-5-甲基四氫葉酸鈣0.12 g，加溶媒至240 ml，溶解后混勻，得高劑量為0.5 mg/ml；取高劑量溶液 70 ml，加溶媒 140 ml，混勻后得中劑量為0.17 mg/ml；取中劑量溶液70 ml，加溶媒70 ml，混勻后得低劑量為0.08 mg/ml，按照小鼠1.0 ml/100g體重給藥。

按照體重將動(dòng)物隨機(jī)分成陰性對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各10只，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別灌胃給予低0.8 mg/（kg·d）、中1.7 mg/（kg·d）、高5.0 mg/（kg·d）劑量的樣品液，陰性對照組灌胃給予同等容積的飲用純凈水。每日給藥1次，連續(xù)30～38 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 小鼠體重及臟器/體重比 動(dòng)物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續(xù)給藥，在第一次給樣品之前（始重）、給樣品的第15天（中重）、給樣品的第30天（終重），稱量小鼠的體重并記錄；實(shí)驗(yàn)第37天，取胸腺和脾臟稱重，計(jì)算胸腺/體重比和脾臟/體重比值。

1.3.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力 動(dòng)物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續(xù)給藥至實(shí)驗(yàn)第36天，處死動(dòng)物，參照瞿飄飄[10]的方法用刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，在570 nm波長處測定吸光值（OD值），根據(jù)式（1）計(jì)算淋巴細(xì)胞的增殖能力。

1.3.3 小鼠遲發(fā)型超敏（delayed type hypersensitivity，DTH）反應(yīng) 動(dòng)物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續(xù)給藥至實(shí)驗(yàn)第34天，腹腔注射0.2 ml 2%（v/v）壓積綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood cell，SRBC）懸液，免疫后的第 4 天，參照何曉波等[11]的方法皮下注射20%(v/v)SRBC，測量攻擊前后其足跖周長間的差值，以此來表示DTH程度。

1.3.4 小鼠抗體生成細(xì)胞溶血空斑數(shù) 動(dòng)物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續(xù)給藥至實(shí)驗(yàn)第31天，腹腔注射0.2 ml 2% （v/v）SRBC懸液進(jìn)行免疫，4 d后處死動(dòng)物，制備脾細(xì)胞懸液（5×106個(gè)/ml），參照李詠梅等[12]方法混合瓊脂糖培養(yǎng)基、10% SRBC（v/v）和脾細(xì)胞懸液，并傾倒在玻片上，加入稀釋后的補(bǔ)體溫育1 h，計(jì)數(shù)溶血的空斑數(shù)。

1.3.5 小鼠血清溶血素測定抗體積數(shù) 動(dòng)物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續(xù)給藥至實(shí)驗(yàn)第34天，腹腔注射0.2 ml 2%（v/v）（SRBC）懸液進(jìn)行免疫，免疫5 d后，收集血清作倍比稀釋，參照趙珺彥等[13]的方法將血清置于微量血凝板，并與等量0.5% SRBC懸液混勻，37℃溫箱中孵育3 h，觀察并記錄血球凝集程度級數(shù)，根據(jù)式（2）計(jì)算出抗體積數(shù)。

式中：倍比稀釋的指數(shù)用1、2、3……n代表，凝集程度級數(shù)用S代表。

1.3.6 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)吞噬指數(shù) 動(dòng)物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續(xù)給藥至實(shí)驗(yàn)第38天，尾靜脈注入墨汁后立即計(jì)時(shí)，參照邱紅梅等[14]的方法在墨汁注入后的2、10 min眼眶取血，加入到2 ml 0.1% Na2CO3溶液中，在600 nm波長處測定OD值，而后稱量肝重、脾重，根據(jù)式（3）（4）計(jì)算吞噬指數(shù)。

1.3.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞數(shù) 動(dòng)物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續(xù)給藥至實(shí)驗(yàn)第37天，向小鼠腹腔內(nèi)注射1 ml 20%（v/v）雞紅細(xì)胞懸液，間隔30 min后處死，參照陳麗芳等[15]的方法取腹腔洗液滴加在載玻片上，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，Giemsa染色后在油鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，依照下式（5）計(jì)算吞噬百分率。

1.3.8 自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK cells）活性測定實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物按照分組分別灌胃給予低、中、高樣品液和飲用純凈水，所有組連續(xù)給藥至實(shí)驗(yàn)第36天，處死動(dòng)物，參照朱鴻哲[16]的方法制備靶細(xì)胞和脾細(xì)胞懸液(效應(yīng)細(xì)胞)，按照效靶比50∶1加入96孔板，放置在37℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔取上清液100 μl置于96孔板，同時(shí)，加入等量LDH基質(zhì)液，反應(yīng)7 min后，每孔加入30 μl 1 mol/L的鹽酸溶液，在490 nm處測OD值，并根據(jù)式（6）計(jì)算NK細(xì)胞的活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重及臟器/體重比

各劑量組小鼠體重隨著給藥時(shí)間延長而增加，與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各劑量組小鼠的脾臟/體重比、胸腺/體重比均低于陰性對照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體重及臟器/體重比值比較（）

表1 各組小鼠體重及臟器/體重比值比較（）

組別 n 始重（g） 中重（g） 終重（g） 胸腺/體重（mg/g） 脾臟/體重（mg/g）陰性對照組 10 18.8±0.4 26.4±0.9 37.2±1.0 1.58±0.22 4.56±0.91低劑量組 10 18.8±0.4 27.0±0.8 37.2±1.3 1.55±0.20 4.12±0.32中劑量組 10 18.8±0.5 26.1±1.1 36.9±1.0 1.52±0.16 4.04±0.40高劑量組 10 18.8±0.5 26.9±1.4 36.7±1.6 1.50±0.20 4.29±0.48 F值 0.090 1.893 0.675 0.327 1.592 P值 0.965 0.143 0.572 0.806 0.208

2.2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和DTH反應(yīng)程度比較

各劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力OD差值隨劑量升高而增加，中、高劑量組顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各劑量組小鼠左后足跖部周長差值均有所增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和DTH反應(yīng)程度比較（）

表2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和DTH反應(yīng)程度比較（）

注：與陰性對照組比較，**P＜0.01

陰性對照組 10 0.251±0.053 0.071±0.023低劑量組 10 0.247±0.042 0.095±0.046中劑量組 10 0.369±0.048** 0.093±0.019高劑量組 10 0.534±0.050** 0.105±0.042 F值 77.535 1.740 P值 0.000 0.176組別 n 淋巴細(xì)胞增殖能力 DTH程度

2.3 各組小鼠抗體生成細(xì)胞溶血空斑數(shù)和血清溶血素抗體積數(shù)比較

各劑量組溶血空斑數(shù)和血清溶血素抗體積數(shù)隨劑量升高而增加，中、高劑量組顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠抗體生成細(xì)胞溶血空斑數(shù)和血清溶血素抗體積數(shù)（）

表3 各組小鼠抗體生成細(xì)胞溶血空斑數(shù)和血清溶血素抗體積數(shù)（）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

陰性對照組 10 28.3±3.2 54.3±8.8低劑量組 10 29.6±3.5 64.3±19.3中劑量組 10 37.0±2.8** 86.6±29.8*高劑量組 10 41.2±2.1** 91.0±29.7**F值 43.553 5.574 P值 0.000 0.003組別 n 溶血空斑數(shù)（個(gè)）/全脾細(xì)胞數(shù) 抗體積數(shù)

2.4 各組小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)吞噬指數(shù)比較

各劑量組吞噬指數(shù)隨劑量升高而增加，顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)吞噬指數(shù)比較（）

表4 各組小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)吞噬指數(shù)比較（）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n 吞噬指數(shù)陰性對照組 10 5.79±0.68低劑量組 10 6.63±0.71*中劑量組 10 6.88±0.91**高劑量組 10 7.10±0.74**F值 5.553 P值 0.003

2.5 各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞指數(shù)比較

各劑量組的吞噬百分率（P）和吞噬指數(shù)X數(shù)值均增加，中、高劑量組顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞指數(shù)（）

表5 各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞指數(shù)（）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05

組別 n 吞噬百分率（%） 吞噬指數(shù)X陰性對照組 10 35.5±1.8 0.638±0.019低劑量組 10 38.7±3.3 0.671±0.034中劑量組 10 40.0±3.2* 0.684±0.033*高劑量組 10 39.6±4.9* 0.680±0.050*F值 3.398 3.407 P值 0.028 0.028

2.6 各組小鼠NK cells活性比較

各劑量組小鼠NK cells活性均增加，顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 各組小鼠NK cells活性比較（）

表6 各組小鼠NK cells活性比較（）

注：與陰性對照組比較，**P＜0.01

組別指數(shù)X陰性對照組 10 3.44±2.72 0.171±0.082低劑量組 10 14.35±4.59** 0.384±0.067**中劑量組 10 22.03±5.80** 0.486±0.067**高劑量組 10 20.97±4.03** 0.474±0.048**F值 37.229 47.167 P值 0.000 0.000

3 討論

本研究中小鼠灌胃給予6S-5-甲基四氫葉酸鈣后，三個(gè)劑量組小鼠體重變化差別不大，脾臟/體重比、胸腺/體重比平均值低于陰性對照組，小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)增強(qiáng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示6S-5-甲基四氫葉酸鈣未顯著改變小鼠體重、臟器重量以及DTH反應(yīng)；低、中、高劑量組小鼠碳廓清功能、NK細(xì)胞活性均顯著增加（P＜0.05），提示6S-5-甲基四氫葉酸鈣能顯著提高小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬能力和NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的能力；中、高劑量組小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力、溶血空斑數(shù)、抗體積數(shù)和巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力均顯著提高（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6S-5-甲基四氫葉酸鈣具有增強(qiáng)小鼠免疫力的作用。

免疫系統(tǒng)是機(jī)體防御外來抗原物質(zhì)的屏障，在機(jī)體免疫應(yīng)答中，通常由非特異性免疫和特異性免疫反應(yīng)共同發(fā)揮作用。免疫能力的強(qiáng)弱與機(jī)體抗病能力和疾病預(yù)后具有密切關(guān)系。巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞均為發(fā)揮免疫功能最重要的免疫指標(biāo)，考察其變化與否是直接評價(jià)人體免疫能力以及各種藥物對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用的重要手段。

本研究采用小鼠和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究了6S-5-甲基四氫葉酸鈣的免疫調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6S-5-甲基四氫葉酸鈣能夠顯著增加巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)，可能是由于其刺激吞噬細(xì)胞數(shù)量增加所致，為非特異性免疫增強(qiáng)的表現(xiàn)形式；NK細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中一類特殊的淋巴細(xì)胞，它可以被激活以介導(dǎo)細(xì)胞毒性活性，并產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子和趨化因子，參與非特異性的抗病毒防御機(jī)制。而且，NK細(xì)胞還在改善造血和實(shí)體器官移植、促進(jìn)抗腫瘤免疫治療、控制炎癥和自身免疫疾病方面具有廣闊的前景[16]。本研究中，三個(gè)劑量組6S-5-甲基四氫葉酸鈣均能顯著提高NK細(xì)胞的活性，提示6S-5-甲基四氫葉酸鈣能夠通過提升這些免疫相關(guān)細(xì)胞活性，從而提高機(jī)體的免疫能力，發(fā)揮治病防病的重要功能。

特異性免疫屬于后天獲得性免疫，通過T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞進(jìn)行抗原特異性的免疫反應(yīng)，特異性免疫反應(yīng)在預(yù)防麻疹和流感嗜血桿菌引起的呼吸道疾病等常見傳染病中至關(guān)重要[17-18]。為了評價(jià)6S-5-甲基四氫葉酸鈣對小鼠體液免疫的影響，本研究測定了給藥后各組溶血空斑數(shù)、抗體積數(shù)，三個(gè)劑量組指標(biāo)均顯著增加，表明參與抗體合成的巨噬細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞亞群的反應(yīng)性增強(qiáng)。細(xì)胞免疫涉及T淋巴細(xì)胞及其產(chǎn)物（淋巴因子)，ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和DTH反應(yīng)需要激活的T淋巴細(xì)胞對給定抗原的特異性識別，從而增殖和釋放細(xì)胞因子，淋巴細(xì)胞增殖能力和DTH反應(yīng)體現(xiàn)了細(xì)胞因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞募集和激活的能力。本研究中，三個(gè)劑量組DTH反應(yīng)均增加，中、高劑量組淋巴細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，小鼠對T細(xì)胞依賴抗原反應(yīng)的增加揭示了6S-5-甲基四氫葉酸鈣對T細(xì)胞的刺激作用。

葉酸是人體必需的維生素，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA的合成，它是一碳代謝的重要甲基供體[19]，補(bǔ)充葉酸對人體健康大有裨益[20-21]。本研究結(jié)果證明了，6S-5-甲基四氫葉酸鈣能夠明顯增強(qiáng)小鼠特異性和非特異性免疫反應(yīng)，提示6S-5-甲基四氫葉酸鈣在免疫增強(qiáng)研究領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景和開發(fā)利用價(jià)值。6S-5-甲基四氫葉酸作為葉酸在血漿中循環(huán)最活躍的形式[22]，它可以避免因葉酸代謝酶基因多態(tài)性導(dǎo)致的葉酸代謝障礙[23-24]，因而具有更高的生物利用度以及生理活性[25]。目前對于6S-5-甲基四氫葉酸鈣的研發(fā)還處在初期階段，未來我們將會(huì)積極探索6S-5-甲基四氫葉酸鈣在免疫和炎癥等方面的開發(fā)和應(yīng)用。

綜上所述，6S-5-甲基四氫葉酸鈣具有增強(qiáng)免疫力功能，為后續(xù)開發(fā)利用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。