石艷紅，楊爽，馬天馳，吳小麗，程小玲，施金榮

（武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430207）

0 引言

吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗用于預(yù)防百日咳、白喉、破傷風(fēng)疾病，武漢公司生產(chǎn)的吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗具有較好的免疫原性及免疫持久性[1]，聯(lián)合疫苗的使用不僅能產(chǎn)生相應(yīng)的疫苗保護(hù)并且減少了接種次數(shù)。對(duì)于細(xì)菌類疫苗的生產(chǎn)，疫苗的免疫原性及免疫效果與菌種的遺傳穩(wěn)定性息息相關(guān)，因此，本文對(duì)生產(chǎn)用菌種破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌、白喉棒桿菌、百日咳博德特氏菌進(jìn)行遺傳學(xué)鑒定研究，監(jiān)測(cè)菌株的遺傳穩(wěn)定性，從源頭保證疫苗的質(zhì)量[2]。

原核生物的rRNA按沉降系數(shù)分為16S、5S和23S rRNA3種，它們分別含有1540、2，900和120個(gè)核苷酸，23S核苷酸含量過(guò)多不易分析，幾乎是16S核苷酸含量的兩倍；5S沒有足夠的遺傳信息并且核苷酸又太少；16S核苷酸長(zhǎng)度適中信息量較大且易分析。16S rDNA是細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列。16S rDNA是細(xì)菌的系統(tǒng)分類研究中最常用和最有用的分子鐘，功能與結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性，素有“細(xì)菌化石”之稱[3]。16S rDNA約1500bp左右，細(xì)菌不同則可變區(qū)序列不同，由于恒定區(qū)序列基本保守，可利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，將16S rDNA片段擴(kuò)增出來(lái)，利用可變區(qū)序列的差異來(lái)對(duì)不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行種類鑒定。16S rDNA鑒定步驟包括細(xì)菌基因組DNA制備、16S rDNA特異引物PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物DNA純化測(cè)序、序列比對(duì)等步驟。是一種快速準(zhǔn)確獲得細(xì)菌種屬信息的方法[4]。

1 材料與方法

1.1 材料菌株。破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌CMCC64008、白喉棒桿菌CMCC38007、百日咳博德特氏菌CMCC58003均來(lái)源中檢院。

1.2 主要試劑。高保真高擴(kuò)增效率PrimeSTAR TM HS DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；GOLDVIEW染料購(gòu)自賽百盛；1KB DNA ladder購(gòu)自Fermentas。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成。利用原核微生物16 SrRNA兩端的保守序列，設(shè)計(jì)出正向引物序列：5'-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'；反向引物序列：5'-AGAAAGGA GGTGATCCAGCC-3'，引物合成由金思瑞生物技術(shù)公司完成。

1.4 16S rDNA擴(kuò)增模板的制備。分別取1支凍干保存的破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌CMCC64008、白喉棒桿菌CMCC38007、百日咳博德特氏菌CMCC58003在微生物限度實(shí)驗(yàn)室內(nèi)復(fù)蘇并用培養(yǎng)基培養(yǎng)一代，挑取菌落溶解于適量0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，將菌懸液濃度調(diào)整到109個(gè)菌/mL，將獲得的菌液100℃水浴15 min后搖勻，取上清，作為PCR擴(kuò)增模板[5]。

1.5 目的16SrDNA擴(kuò)增。分別以破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌、白喉棒桿菌、百日咳博德特氏菌菌液為模板，擴(kuò)增16S rDNA，破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌、白喉棒桿菌16S rDNA擴(kuò)增反應(yīng)條件：98℃變性10 s，52℃退火15 s，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；百日咳博德特氏菌16S rRNA擴(kuò)增反應(yīng)條件：98℃變性10s，66℃退火5 s，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外分析儀下觀察結(jié)果。并將擴(kuò)增產(chǎn)物送金思瑞生物技術(shù)公司純化測(cè)序[6]。

2 結(jié)果

16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果。用紫外分析儀觀察到16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)物在1500bp處有單一且很亮條帶[7]，見圖1。

圖1 各細(xì)菌16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.2 各細(xì)菌16S rDNA測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)已知同種類序列比對(duì)結(jié)果，同源性均為99%。

3 討論

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，體現(xiàn)出傳統(tǒng)的微生物鑒定方法的局限性，基于基因的分子鑒定方法已被廣泛應(yīng)用。16S rDNA的序列包含9或10個(gè)可變區(qū)和11個(gè)恒定區(qū)[8]。生物物種間的親緣關(guān)系由保守序列區(qū)域來(lái)反映，物種間的特異性通過(guò)高變序列區(qū)域來(lái)體現(xiàn)。根據(jù)細(xì)菌的16S rDNA中的序列設(shè)計(jì)出通用物，通過(guò)PCR反應(yīng)可以擴(kuò)增出相關(guān)細(xì)菌的16S rDNA片段，這些引物不會(huì)與非細(xì)菌的DNA互補(bǔ)，僅對(duì)細(xì)菌是特異性的，通過(guò)不同的細(xì)菌16S rDNA可變區(qū)的差異來(lái)區(qū)分[9-10]。隨著核酸測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，16S rDNA序列已成為細(xì)菌基因鑒定的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)識(shí)。越來(lái)越多已測(cè)定的16S rDNA序列被收入國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)16S rDNA序列進(jìn)行細(xì)菌基因鑒定更加方便快捷[11]。

目前細(xì)菌的16S rDNA鑒定技術(shù)廣泛應(yīng)用于多行業(yè)研究領(lǐng)域，該技術(shù)可高效核酸提取和16S rDNA基因測(cè)序用于細(xì)菌群落鑒定，臨床上用于疾病的診斷，可以快速準(zhǔn)確診斷出病原菌，從而讓病人得到有效的治療，也用于細(xì)菌種屬的鑒定，在疫苗研究領(lǐng)域用于保護(hù)性抗原基因序列的遺傳穩(wěn)定性研究[12]，該技術(shù)應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)用細(xì)菌的遺傳鑒定的報(bào)道較少，隨著菌種在相應(yīng)的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，可能會(huì)有潛在污染的風(fēng)險(xiǎn)，污染的外源病毒或微生物會(huì)伴隨復(fù)制，從而引起菌種的生物學(xué)特性或遺傳穩(wěn)定性發(fā)生變異，本文采用細(xì)菌的16S rDNA鑒定技術(shù)監(jiān)測(cè)疫苗生產(chǎn)菌種遺傳穩(wěn)定性給疫苗安全有效提供了有力保障。

《中國(guó)藥典》2020年版三部明確規(guī)定應(yīng)建立生產(chǎn)用菌毒種主種子批基因序列背景資料[13]，作為生產(chǎn)疫苗用的菌種這樣一種特殊生物材料，遺傳穩(wěn)定性是重要的質(zhì)控指標(biāo)[14]，也可預(yù)測(cè)和預(yù)警現(xiàn)有疫苗菌種對(duì)當(dāng)前疾病流行株的防病效果。本研究對(duì)武漢公司無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗生產(chǎn)用菌種的16S rDNA的序列進(jìn)行了測(cè)定，通過(guò)與GeneBank中同種類已知序列進(jìn)行比對(duì)，同源性均為99%，說(shuō)明這3種生產(chǎn)用菌種均是安全的，從基因水平上進(jìn)一步說(shuō)明武漢生物制品研究所生產(chǎn)的無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗是安全有效的。