石艷紅，楊爽，馬天馳，吳小麗，程小玲，施金榮

（武漢生物制品研究所有限責任公司，湖北 武漢 430207）

0 引言

吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗用于預防百日咳、白喉、破傷風疾病，武漢公司生產(chǎn)的吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗具有較好的免疫原性及免疫持久性[1]，聯(lián)合疫苗的使用不僅能產(chǎn)生相應的疫苗保護并且減少了接種次數(shù)。對于細菌類疫苗的生產(chǎn)，疫苗的免疫原性及免疫效果與菌種的遺傳穩(wěn)定性息息相關，因此，本文對生產(chǎn)用菌種破傷風梭狀芽胞桿菌、白喉棒桿菌、百日咳博德特氏菌進行遺傳學鑒定研究，監(jiān)測菌株的遺傳穩(wěn)定性，從源頭保證疫苗的質量[2]。

原核生物的rRNA按沉降系數(shù)分為16S、5S和23S rRNA3種，它們分別含有1540、2，900和120個核苷酸，23S核苷酸含量過多不易分析，幾乎是16S核苷酸含量的兩倍；5S沒有足夠的遺傳信息并且核苷酸又太少；16S核苷酸長度適中信息量較大且易分析。16S rDNA是細菌染色體上編碼16S rRNA相對應的DNA序列。16S rDNA是細菌的系統(tǒng)分類研究中最常用和最有用的分子鐘，功能與結構上具有高度的保守性，素有“細菌化石”之稱[3]。16S rDNA約1500bp左右，細菌不同則可變區(qū)序列不同，由于恒定區(qū)序列基本保守，可利用恒定區(qū)序列設計引物，將16S rDNA片段擴增出來，利用可變區(qū)序列的差異來對不同菌屬、菌種的細菌進行種類鑒定。16S rDNA鑒定步驟包括細菌基因組DNA制備、16S rDNA特異引物PCR擴增、擴增產(chǎn)物DNA純化測序、序列比對等步驟。是一種快速準確獲得細菌種屬信息的方法[4]。

1 材料與方法

1.1 材料菌株。破傷風梭狀芽胞桿菌CMCC64008、白喉棒桿菌CMCC38007、百日咳博德特氏菌CMCC58003均來源中檢院。

1.2 主要試劑。高保真高擴增效率PrimeSTAR TM HS DNA聚合酶購自TaKaRa公司；GOLDVIEW染料購自賽百盛；1KB DNA ladder購自Fermentas。

1.3 引物設計及合成。利用原核微生物16 SrRNA兩端的保守序列，設計出正向引物序列：5'-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'；反向引物序列：5'-AGAAAGGA GGTGATCCAGCC-3'，引物合成由金思瑞生物技術公司完成。

1.4 16S rDNA擴增模板的制備。分別取1支凍干保存的破傷風梭狀芽胞桿菌CMCC64008、白喉棒桿菌CMCC38007、百日咳博德特氏菌CMCC58003在微生物限度實驗室內(nèi)復蘇并用培養(yǎng)基培養(yǎng)一代，挑取菌落溶解于適量0.9%無菌氯化鈉溶液中，將菌懸液濃度調(diào)整到109個菌/mL，將獲得的菌液100℃水浴15 min后搖勻，取上清，作為PCR擴增模板[5]。

1.5 目的16SrDNA擴增。分別以破傷風梭狀芽胞桿菌、白喉棒桿菌、百日咳博德特氏菌菌液為模板，擴增16S rDNA，破傷風梭狀芽胞桿菌、白喉棒桿菌16S rDNA擴增反應條件：98℃變性10 s，52℃退火15 s，72℃延伸90 s，共30個循環(huán)；百日咳博德特氏菌16S rRNA擴增反應條件：98℃變性10s，66℃退火5 s，72℃延伸90 s，共30個循環(huán)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外分析儀下觀察結果。并將擴增產(chǎn)物送金思瑞生物技術公司純化測序[6]。

2 結果

16SrDNA擴增產(chǎn)物凝膠電泳結果。用紫外分析儀觀察到16S rDNA擴增產(chǎn)物產(chǎn)物在1500bp處有單一且很亮條帶[7]，見圖1。

圖1 各細菌16SrDNA擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.2 各細菌16S rDNA測序結果與基因庫已知同種類序列比對結果，同源性均為99%。

3 討論

隨著生物技術的發(fā)展，體現(xiàn)出傳統(tǒng)的微生物鑒定方法的局限性，基于基因的分子鑒定方法已被廣泛應用。16S rDNA的序列包含9或10個可變區(qū)和11個恒定區(qū)[8]。生物物種間的親緣關系由保守序列區(qū)域來反映，物種間的特異性通過高變序列區(qū)域來體現(xiàn)。根據(jù)細菌的16S rDNA中的序列設計出通用物，通過PCR反應可以擴增出相關細菌的16S rDNA片段，這些引物不會與非細菌的DNA互補，僅對細菌是特異性的，通過不同的細菌16S rDNA可變區(qū)的差異來區(qū)分[9-10]。隨著核酸測序技術的發(fā)展，16S rDNA序列已成為細菌基因鑒定的標準標識。越來越多已測定的16S rDNA序列被收入國際基因數(shù)據(jù)庫中，通過16S rDNA序列進行細菌基因鑒定更加方便快捷[11]。

目前細菌的16S rDNA鑒定技術廣泛應用于多行業(yè)研究領域，該技術可高效核酸提取和16S rDNA基因測序用于細菌群落鑒定，臨床上用于疾病的診斷，可以快速準確診斷出病原菌，從而讓病人得到有效的治療，也用于細菌種屬的鑒定，在疫苗研究領域用于保護性抗原基因序列的遺傳穩(wěn)定性研究[12]，該技術應用于疫苗生產(chǎn)用細菌的遺傳鑒定的報道較少，隨著菌種在相應的培養(yǎng)基中擴增，可能會有潛在污染的風險，污染的外源病毒或微生物會伴隨復制，從而引起菌種的生物學特性或遺傳穩(wěn)定性發(fā)生變異，本文采用細菌的16S rDNA鑒定技術監(jiān)測疫苗生產(chǎn)菌種遺傳穩(wěn)定性給疫苗安全有效提供了有力保障。

《中國藥典》2020年版三部明確規(guī)定應建立生產(chǎn)用菌毒種主種子批基因序列背景資料[13]，作為生產(chǎn)疫苗用的菌種這樣一種特殊生物材料，遺傳穩(wěn)定性是重要的質控指標[14]，也可預測和預警現(xiàn)有疫苗菌種對當前疾病流行株的防病效果。本研究對武漢公司無細胞百白破聯(lián)合疫苗生產(chǎn)用菌種的16S rDNA的序列進行了測定，通過與GeneBank中同種類已知序列進行比對，同源性均為99%，說明這3種生產(chǎn)用菌種均是安全的，從基因水平上進一步說明武漢生物制品研究所生產(chǎn)的無細胞百白破聯(lián)合疫苗是安全有效的。