陳波,李莊,張本斯(.湖南師范大學附屬湘東醫(yī)院,湖南 株洲 400;.大理大學第一附屬醫(yī)院,云南 大理 67000;.大理大學基礎醫(yī)學院,云南 大理 67000）

近年來，隨著分子生物學、遺傳學、免疫學、生物技術等學科的發(fā)展，我國在對乳腺癌的臨床研究上取得了巨大的發(fā)展，對乳腺癌生物學標志物的研究達幾十種之多，并且還在不斷增加，如ER、PR、HER-2、CD44、P53、Ki67、muc-1、mdrl等，其中研究較為深入的為HER-2、ER、PR，并且在對乳腺癌的治療及預后評價中應用最多。但是其特異性以及敏感性仍然不夠理想，所以，尋找一個對乳腺癌更具有特異性及敏感性的分子標志物顯得尤為迫切。

表l EphA2蛋白在乳腺癌中的表達與臨床病理因素的關系

而近年來Eph（erythropoitin producing hepatocellular carcinoma）受體家族被發(fā)現(xiàn)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、轉移及血管生成相關，可作為潛在的腫瘤分子標志物及治療靶點[1-4]。在乳腺癌中，Eph/ephrin信號同樣具有促進腫瘤進展和血管生成、調(diào)節(jié)腫瘤干細胞穩(wěn)態(tài)、抑制腫瘤發(fā)展等多面作用，且Eph/ephrin表達譜與乳腺癌患者的臨床結果相關[5-7]。

本研究主要通過免疫組化的方法來檢測乳腺癌中EphA2受體及配體EphrinA1的表達情況。并且通過統(tǒng)計學方法來探討乳腺癌中EphA2受體及其配體EphrinA1的表達與臨床病理因素的關系，以期對乳腺癌的治療和預后提供一個新的思路。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料和組織樣本 選取云南省大理大學附屬醫(yī)院93例術前未行放療、化療或其他特殊治療的各民族女性乳腺癌手術切除標本及病人的臨床病例信息。所選患者的臨床資料包括年齡、腫瘤大小、病理類型、臨床分期、淋巴結轉移和組織學分級等。所取腫瘤標本的病理類型、淋巴結轉移和組織學分級等病理參數(shù)均來自于病理報告。

1.1.2 主要試劑與儀器 EphA2兔/羊抗人多克隆抗體（adcam公司），EphrinA1兔抗人多克隆抗體（invitrogen公司），SP免疫組化試劑盒（SP9710）(福州邁新生物技術有限公司），DAB顯色劑（福州邁新生物技術有限公司），石蠟切片機（MICROM公司），光學顯微鏡（OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 病理切片的制作 我們將含有腫瘤組織的蠟塊重新包埋后，由病理科技術人員以5μm的厚度連續(xù)切片，每個蠟塊切片10張，并且將每個蠟塊切成的10張切片分成兩等份，其中5張切片上用鉛筆寫上EphA2作為標記，另外5張切片用鉛筆寫上EphrinA1作為標記。

1.2.2 基本步驟分為：組織切片、水化、封閉內(nèi)源性過氧化物酶—修復抗原并暴露抗原決定簇—封閉特異性蛋白—加入一抗、二抗進行孵育、SP反應—顯色劑—蘇木精復染、脫水、封片—光學顯微鏡下觀察。設置兩組對照組：以PBS緩沖液代替一抗及二抗，設置對照組。

1.3 結果判定 每例切片隨機選擇5個高倍鏡視野，計數(shù)500個以上細胞，根據(jù)著色細胞占腫瘤細胞數(shù)的比例來分為(-)和(+)。EphA2蛋白：細胞膜和細胞漿同時染成棕黃色或棕褐色的細胞，每5個高倍視野＞20%者為陽性，否則為陰性病例。EphrinA1蛋白：細胞膜和細胞漿同時染成棕黃色或棕褐色的細胞，每5個高倍視野＞10%者為陽性著色，否則為陰性。結果判斷均由兩名高年資病理科醫(yī)生統(tǒng)一核準。

1.4 統(tǒng)計分析 應用SPSS統(tǒng)計軟件分析，樣本率的比較采用χ2檢驗（當有1個格子的理論數(shù)小于5時，采用Continuity Correction法，當有1個格子的理論數(shù)小于1或者1/5以上格子的理論數(shù)小于5時，采用Fisher’s Exact test法，其余均采用Pearson（Chi-Square）法）；相關聯(lián)性分析采用χ2檢驗，檢驗標準均取P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EphA2蛋白在乳腺癌標本中的表達情況 在所選取的93例乳腺癌標本中，EphA2蛋白的陽性表達為74例，陽性表達率為79.57%。見圖1、圖2。

圖1 EphA2在乳腺癌中的陽性表達(SP×200)

圖2 EphA2在乳腺癌中的陽性表達(SP×400)

2.2 EphA2蛋白在乳腺癌的陽性表達率與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結轉移和組織學分級的關系 據(jù)表1分析，EphA2蛋白在細胞內(nèi)的表達與患者年齡、腫瘤大小、病理類型、TNM分期無顯著差異（P＞0.05），而與淋巴結轉移、腫瘤的組織學分級相關（P＜0.05），組織學分級越高，EphA2蛋白在下乳腺癌細胞內(nèi)陽性表達所占的比例越高。

在所選取的93例乳腺癌標本中，EphrinA1蛋白的陽性表達為70例，陽性表達率為75.27%。見圖3、圖4。

圖3 EphrinA1在乳腺癌中的陽性表達(SP×200)

圖4 EphrinA1在乳腺癌中的陽性表達(SP×400)

2.3 EphrinAl蛋白在乳腺癌的陽性表達率與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結轉移和組織學分級的關系 據(jù)表2分析，EphrinA1蛋白在細胞內(nèi)的表達和EphA2蛋白在細胞內(nèi)的表達非常相似，與患者年齡、腫瘤大小、病理類型、TNM分期無顯著差異（P＞0.05），而與淋巴結轉移、腫瘤的組織學分級相關（P＜0.05），并且組織學分級越高，EphrinA1蛋白在下乳腺癌細胞內(nèi)陽性表達所占的比例越高。通過表1與表2的綜合分析，說明EphA2蛋白與EphrinA1蛋白在細胞內(nèi)的表達有非常緊密的聯(lián)系。據(jù)表3分析，EphA2蛋白與EphrinA1蛋白之間無顯著差異（P＞0.05），說明EphA2和EphrinA1之間存在相關性。有文獻報道，EphA2在細胞內(nèi)的表達可以作用于EphrinA1，促進其在細胞內(nèi)的表達。

表2 EphrinA1蛋白在乳腺癌中的表達與臨床病理因素的關系

表3 乳腺癌中EphA2的表達與EphrinA1表達的關系

3 討論

即使乳腺癌患者有著相同的臨床分期、相同的病理類型、相同的組織學分級，經(jīng)過相同方案的手術治療以及相同的放化療方案，但其預后仍然存在較大的差異，說明個體的差異性對乳腺癌的預后影響很大。隨著現(xiàn)代分子生物學的高速發(fā)展，醫(yī)學研究已經(jīng)進入分子水平時代，傳統(tǒng)的病理組織學分類已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代醫(yī)學的研究及發(fā)展。尋找出能夠幫助乳腺癌診治及預后的分子生物學已經(jīng)成為目前研究的熱點之一。

EphrinA1是第一個被發(fā)現(xiàn)的Eph受體亞家族的配體。很多研究表明，Eph家族與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，而Eph家族也越來越受到關注。

許多國外學者研究發(fā)現(xiàn)，EphA2和EphrinA1在乳腺癌中的高表達與乳腺癌的進展有關，EphA2與EphrinA1的表達隨乳腺癌惡性程度的增高而逐漸增加，并且與乳腺癌患者的生存狀態(tài)有關。

EphA2受體與EphrinA1配體之間的多種交叉結合，以及與其他因子的相互作用，還有在不同細胞里的表達情況，使得其在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到的作用非常復雜，關于它在乳腺癌中的作用機制尚不明確，它也受到了國內(nèi)外越來越多的學者的重視，對其的研究也越來越多，相信不久的將來，其能夠成為腫瘤分子水平治療的新靶點。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，EphA2蛋白和EphrinA1蛋白共同表達于乳腺癌組織中，且與其乳腺癌的淋巴結轉移、組織學分級相關，而乳腺癌的淋巴結轉移和組織學分級又對其治療和預后有著很重要的影響。所以EphA2蛋白和EphrinA1蛋白有望作為乳腺癌惡性程度及預后的一個指標，也能對乳腺癌的早期診治及預后提供幫助。

綜上所述，EphA2蛋白及EphrinA1蛋白的檢測可以作為一個指標來指導乳腺癌的臨床治療以及用來評估患者的預后。但是乳腺癌是一個由多因素引起的疾病，我們需結合其他因素及指標來綜合判斷與分析，才能為乳腺癌的治療開辟一條新的大道。