焦 陽(yáng)，李 娜，黃銀盈，黃櫻櫻，鄒愛華，趙云龍

(1. 華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 上海 200241； 2. 國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心(上海)，上海 201204；3. 華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237)

農(nóng)藥在控制害蟲、提高作物產(chǎn)量方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，然而過度使用農(nóng)藥給人類和環(huán)境帶來(lái)了很大威脅[1-2].每年有數(shù)百萬(wàn)噸農(nóng)藥投入使用，約有90%的農(nóng)藥會(huì)流入環(huán)境，部分還會(huì)殘留在農(nóng)產(chǎn)品中[3-4].農(nóng)藥的低效使用導(dǎo)致了一系列問題，如土壤退化、生物多樣性喪失等[5].因此有必要開發(fā)新型農(nóng)藥來(lái)緩解傳統(tǒng)農(nóng)藥的不足.近些年來(lái)納米科技發(fā)展迅速，利用納米技術(shù)合成的納米農(nóng)藥有廣闊的應(yīng)用前景[6].

納米農(nóng)藥中，常用的農(nóng)藥緩釋載體類型多樣，以聚合物為基質(zhì)的納米材料，例如納米微膠囊、納米顆粒、膠體、凝膠；以脂質(zhì)為基質(zhì)的納米材料，例如脂質(zhì)體、固體納米顆粒等[7-8].以上納米緩釋載體中，微膠囊(Microcapsule)作為緩釋載體具有良好的效果，可以減少對(duì)環(huán)境的污染，載藥量相對(duì)較高，因此微膠囊常用作納米農(nóng)藥的緩釋載體[9].

微膠囊由核-殼構(gòu)成，其殼成分大多為聚合物或涂層[10].聚多巴胺(Polydopamine, PDA)是一種黑色素材料，因其良好的分散性、黏附性及相容性而在各領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力[11]，聚多巴胺作為藥物緩釋載體負(fù)載的紫杉醇和姜黃素體系在解決化療產(chǎn)生的細(xì)胞耐藥性上具有一定的應(yīng)用前景[12].高效氯氟氰菊酯(Lambda Cyhalothrin， LC)以傳統(tǒng)劑型為主，具有粉塵飄逸、分散性差等不足[13]，制備高效氯氟氰菊酯緩釋制劑已成為人們的關(guān)注點(diǎn).本文所用農(nóng)藥是在已有研究基礎(chǔ)上，以聚多巴胺作為緩釋載體負(fù)載高效氯氟氰菊酯制備得到的高效氯氟氰菊酯聚多巴胺微膠囊懸浮劑(Lambda Cyhalothrin/Polydopamine-Microcapsule Suspension, LC/PDA-MS).

中華絨螯蟹是我國(guó)重要的淡水甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖物種，稻蟹種養(yǎng)模式是我國(guó)重要的水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖模式之一[14].商業(yè)推薦高效氯氟氰菊酯在稻田中的使用劑量為22.5 g/ha[15]，納米農(nóng)藥利用噴灑方式應(yīng)用于稻田，是否會(huì)影響共養(yǎng)體系中水生生物的產(chǎn)量和安全是其中比較關(guān)鍵的問題.LC/PDA-MS對(duì)斑馬魚的毒性實(shí)驗(yàn)中，LC/PDA-MS較未使用緩釋載體的高效氯氟氰菊酯(LC)毒性小，緩釋載體起到了一定的降低毒性的作用[16].因此本文以水生經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖生物中華絨螯蟹為研究對(duì)象，選用LC/PDA-MS為納米農(nóng)藥，研究不同濃度懸浮劑及空白懸浮劑對(duì)中華絨螯蟹非特異性免疫和腸道微生物豐度以及多樣性的影響，以期為納米農(nóng)藥在綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)養(yǎng)殖用量方面提供生物學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用中華絨螯蟹于2019年3月購(gòu)置于上海海洋大學(xué)崇明養(yǎng)殖基地，為避免性別造成的影響，只選用雌蟹進(jìn)行實(shí)驗(yàn).在正式實(shí)驗(yàn)前，選取600只健康有活力的雌性中華絨螯蟹(10.0±2.0) g放置于水族箱(48 cm×34 cm×26 cm)中暫養(yǎng)一周，密度為20只每箱，每個(gè)水箱放置15 L水，在水族箱底部放置PVC管作為遮蔽物，實(shí)驗(yàn)用水為充分曝氣的自來(lái)水，水溫為(19±1) ℃，pH為(7.6±0.5)，24 h連續(xù)曝氣，保持溶解氧在(6.2±0.6) mg/L范圍內(nèi).在此期間，每天早上和晚上喂食一次，每48 h換一次水，及時(shí)清理蟹的排泄物，在正式實(shí)驗(yàn)前不喂食.

實(shí)驗(yàn)所用高效氯氟氰菊酯聚多巴胺微膠囊懸浮劑由華東理工大學(xué)提供.空白聚多巴胺微膠囊采用逐層組裝法(LBL)合成，將空白干燥的空白聚多巴胺微膠囊放入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中用高效氯氟氰菊酯分散，磁力攪拌24 h獲得高效氯氟氰菊酯聚多巴胺微膠囊[17]，然后將分散劑、黃原膠、消泡水溶液混合，制備了2.5%的高效氯氟氰菊酯聚多巴胺微膠囊懸浮劑[16].

1.2 慢性毒性實(shí)驗(yàn)

選取18個(gè)水族箱(48 cm×34 cm×26 cm)，加入高效氯氟氰聚多巴胺微膠囊懸浮劑和水配制成的不同濃度的溶液，每個(gè)水族箱中放入15 L水，20只中華絨螯蟹，根據(jù)半致死濃度(LC50=6.4 mg/L)以及文獻(xiàn)中慢性毒性實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置比例，按照半致死濃度的1/500、1/100、1/50、1/10設(shè)置4個(gè)濃度組，另外設(shè)置對(duì)照組以及空白懸浮劑組(即不載有高效氯氟氰菊酯的聚多巴胺微膠囊懸浮劑)，其濃度設(shè)置為半致死濃度的1/10，具體結(jié)果另文發(fā)表.實(shí)驗(yàn)期間養(yǎng)殖管理同暫養(yǎng)期間的環(huán)境保持一致，每48 h更換一次水溶液.定期記錄中華絨螯蟹的生長(zhǎng)、健康狀況，分別于7 d、14 d、21 d取樣分析.

1.3 樣品制備

取樣前，先饑餓處理24 h，每個(gè)水族箱中隨機(jī)取2只中華絨螯蟹，解剖前用去離子水沖洗表面以去除殘余農(nóng)藥，隨后將中華絨螯蟹置于冰上麻醉，用一次性注射器于中華絨螯蟹幼蟹足基部抽取血淋巴，按1∶1的比例加入抗凝劑(檸檬酸8.42 g，檸檬酸鈉3.52 g,NaCl 8.96 g，EDTA-Na20.74 g，雙蒸水200 mL，pH 7.3～7.4)，以3 500 r/min離心15 min，將血清和血細(xì)胞分離.隨后用鑷子和剪刀取肝胰腺、腸等組織放入2 mL離心管中，迅速放入液氮中，隨后放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.4 Real-time qPCR檢測(cè)

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RT-qPCR)檢測(cè)肝表達(dá)量，相關(guān)基因的引物序列如表1(見第464頁(yè))所示.剪取約30 mg肝胰腺組織和離心后的血細(xì)胞放置于無(wú)酶離心管中，加入RT plus裂解液，用試劑盒提取RNA(北京，艾德萊)，其純度和質(zhì)量通過A260/A280檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，其操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行(南京，諾唯贊).qPCR試劑盒使用TransStart?Top Green qPCR SuperMix (北京，全式金)，20 μL的反應(yīng)體系包括1 μL cDNA、上下游引物各0.4 μL、10 μL SYBR、8.2 μL ddH2O, 每一組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，此反應(yīng)體系置于96孔板中，使用qPCR儀(Bio-Rad, USA)檢測(cè)，將程序設(shè)置為95 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s.

表1 用于RT-qPCR的引物序列

1.5 DNA提取

根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, US)說(shuō)明書對(duì)中華絨螯蟹對(duì)照組、0.60 mg/L和空白懸浮劑組的腸道進(jìn)行DNA抽提，其純度和濃度用NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)進(jìn)行檢測(cè).

1.6 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

將提取到的DNA擴(kuò)增利用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHV-GGGTWTCTAAT-3’)對(duì)V3～V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.將擴(kuò)增產(chǎn)物回收利用Axyprep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 純化，所得片段用QuantiFluorTM-ST (Promega, USA)進(jìn)行定量檢測(cè)，利用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序.

1.7 Illumina數(shù)據(jù)處理

獲得的原始序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，用Flash軟件進(jìn)行拼接.使用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除單序列和嵌合體.

1.8 數(shù)據(jù)分析

熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算免疫相關(guān)基因的表達(dá)量，所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007、SPSS 23和Graph pad 7分析，結(jié)果用平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，若方差齊性，用單因素方差(One-way ANOVA)進(jìn)行分析,運(yùn)用Turkey對(duì)不同組間的均值進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，顯著水平設(shè)置為P<0.05；若方差不齊性，則運(yùn)用Kruskal-Wallis進(jìn)行檢驗(yàn)，同時(shí)采用雙因素方差分析各免疫基因在7 d、14 d、21 d之間的差異，顯著水平設(shè)置為P<0.05.

2 結(jié) 果

經(jīng)過21天慢性毒性實(shí)驗(yàn)，對(duì)中華絨螯蟹生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組0.012 mg/L，0.06 mg/L，0.12 mg/L,0.60 mg/L及空白懸浮劑組對(duì)中華絨螯蟹的存活率分別為93.3%,92%,87%,87%,83%,95%.具體結(jié)果另文發(fā)表.

2.1 血細(xì)胞中免疫相關(guān)基因的表達(dá)量

LC/PDA-MS及空白懸浮劑對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞中免疫相關(guān)基因的影響如圖1(見第466頁(yè))所示.圖1(a)顯示，Propo基因在第7天，0.012 mg/L、0.06 mg/L組呈上升趨勢(shì)且較對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05),其他組與對(duì)照組無(wú)顯著差異；在第14天，0.012 mg/L、0.06 mg/L、0.12 mg/L組呈上升趨勢(shì)(P<0.05);在第21天，0.06 mg/L組和空白懸浮劑組顯著升高(P<0.05).圖1(b)顯示Caspase基因在7、14 d的表達(dá)量較對(duì)照組呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在21天時(shí)，除0.06 mg/L組其他組與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P>0.05).圖1(c)顯示myD88基因在第7天隨著濃度的增加，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；隨著時(shí)間的增加(14 d),myD88基因表達(dá)水平在0.012 mg/L、0.60 mg/L組較對(duì)照組呈下降趨勢(shì)，其他組較對(duì)照組呈上升趨勢(shì)且有顯著性差異(P<0.05)；在21 d，myD88基因呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，空白懸浮劑組與對(duì)照組無(wú)顯著差異.圖1(d)顯示PPAF基因在第7天除0.60 mg/L組較對(duì)照組呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；在14 d，0.060 mg/L組顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其他組與對(duì)照組無(wú)顯著差異；在21 d，空白懸浮劑組PPAF基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05),0.06 mg/L組較對(duì)照組呈現(xiàn)上升趨勢(shì)但無(wú)顯著性差異(P>0.05).圖1(e)顯示Crustin基因在7 d、14 d時(shí)0.06 mg/L組較對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)，在21 d時(shí)，Crustin基因呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，然而空白懸浮劑組較對(duì)照組呈上升趨勢(shì)(P<0.05).溶菌酶基因LZM呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中在7 d、14 d空白懸浮劑組與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.05)，如圖1(f)所示.

圖1 LC/PDA-MS處理后血細(xì)胞中免疫相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.1 Effects of LC/PDA-MS exposure on the expression of immune genes in the haemocytes條形圖上方的不同字母代表著處理組間存在著顯著差異(P<0.05).

2.2 肝胰腺中免疫相關(guān)基因的表達(dá)量

LC/PDA-MS及空白懸浮劑對(duì)肝胰腺中免疫相關(guān)基因的表達(dá)量影響如圖2(見第466頁(yè))所示.Propo和PPAF基因表達(dá)呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，在7 d、14 d，各濃度處理組基因表達(dá)量與對(duì)照組相比呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；在21 d，Propo基因在0.012 mg/L、0.06 mg/L、空白懸浮經(jīng)濟(jì)組較對(duì)照組表達(dá)量高且有顯著性差異(P<0.05)，PPAF基因表達(dá)量與對(duì)照組相比呈上升趨勢(shì),結(jié)果如圖2(a)、(d)所示.Caspase基因表達(dá)量隨著濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且空白懸浮劑組在第7天有顯著性差異(P<0.05),隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(14 d、21 d)，空白懸浮劑組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，結(jié)果如圖2(b)所示.在第7天，myD88基因在各濃度組較對(duì)照組均有顯著性差異(P<0.05)，在第14天、21天，隨著濃度的增加，除空白懸浮劑組，其他各濃度組與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05),結(jié)果如圖2(c) 所示.Crustin基因在7 d時(shí)隨濃度的增加基因表達(dá)水平升高，在14 d，除空白對(duì)照組外，其余各組較對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05),且在0.12 mg/L組達(dá)到峰值；在21 d，除0.6 mg/L組，其余各組較對(duì)照組呈上升趨勢(shì)，結(jié)果如圖2(e)所示.LZM基因表達(dá)量在7 d、14 d隨濃度的增加而升高；在21 d，LZM基因表達(dá)量先升高后下降，且在0.12 mg/L、0.60 mg/L組與對(duì)照組相比顯著下降(P<0.05)，結(jié)果如圖2(f)所示.

圖2 不同濃度懸浮劑組處理后肝胰腺中免疫相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.2 Effects of LC/PDA-MS exposure on the expression of immune genes in the hepatopancreas條形圖上方的不同字母代表組間具有顯著差異性(P<0.05).

2.3 腸道菌群豐度和多樣性分析

通過分析得出每組中華絨螯蟹中平均約45 349個(gè)(38 635～50 685個(gè))序列.空白懸浮劑組Chao1指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，0.60 mg/L組Chao1指數(shù)最低，從而導(dǎo)致菌群多樣性降低，結(jié)果如表2(見第466頁(yè))所示.Ace指數(shù)與Chao1呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，0.60 mg/L組低于對(duì)照組但無(wú)顯著性差異(P>0.05).Simpson指數(shù)(Simpson index)和Shannon指數(shù)(Shannon index)分別是0.11至0.19和2.49至2.84，這兩個(gè)指標(biāo)之間沒有顯著性差異(P>0.05).

表2 LC/PDA-MS暴露后基于OUT分析中華絨螯蟹腸道菌群的豐度

利用Venn圖計(jì)算了多個(gè)樣本中OTU個(gè)數(shù)，從而揭示不同樣本中OTU數(shù)目的相似性和重疊性.其中有166個(gè)OTUs單元一致(圖3(a)).獨(dú)有的OTUs方面，對(duì)照組有69個(gè)，空白組有86個(gè)，0.60 mg/L LC/PDA-MS組僅有38個(gè).

圖3 不同處理組中OTUs相對(duì)豐度的維恩圖Fig.3 Venn diagram showing the unique and shared OTUs in LC PDA exposure.(a) 顯示了各組獨(dú)有和共有的OTU；(b) 各組總OTU個(gè)數(shù)；“C”： 對(duì)照組；“S”： 0.60 mg/L LC/PDA-MS組；Blank： 空白懸浮劑組.

2.4 腸道菌群組成和比較

如圖4(a)所示，基于中華絨螯蟹腸道微生物在門水平上的分析得出優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacterodidetes)、軟壁菌門(Tenericutes)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)，以上優(yōu)勢(shì)菌門在對(duì)照組所占比例為48.16%，5.95%，29.62%，4.92%，10.11%，在0.60 mg/L LC/PDA-MS組所占比例為70.32%，14.79%，13.06%，1.307%，0.27%，在空白懸浮劑組所占比例為35.18%，22.49%，33.77%，6.71%，0.97%，其中擬桿菌門在各對(duì)照組之間有顯著性差異(P<0.05)，結(jié)果如圖4(b)所示.暴露21 d后不同處理組中華絨螯蟹腸道菌群在屬水平上的分析，結(jié)果如圖5(見第468頁(yè))所示.共得到33個(gè)屬.其中有10個(gè)屬的豐度相對(duì)較高，占整個(gè)中華絨螯蟹腸道菌群的70%以上，分別是Candidatus_Bacilloplasma、希瓦氏菌屬(Shewanella)、鮑曼不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、norank_f_Mycoplasmataceae、Roseimarinus、副球菌屬(Paracoccus).相比于對(duì)照組，空白懸浮劑組中希瓦氏菌含量相對(duì)較低，黃桿菌在處理組的含量有所上升，但與對(duì)照組無(wú)顯著性差異.空白懸浮劑組氣單胞菌含量較對(duì)照組含量較少，但與對(duì)照組無(wú)顯著性差異,結(jié)果如圖5(b)所示.

圖4 (a) 不同濃度處理組暴露后基于門水平上中華絨螯蟹腸道菌群的豐度熱力圖； (b) 不同處理后最豐富的6個(gè)門的Kruskal-Wallis分析檢驗(yàn)Fig.4 (a) Heatmap of the abundance of Eriocheir sinensis intestinal bacteria at the phylum level at different LC/PDA-MS concentrations;(b) Kruskal-Wallis test of the most abundant six phylums in different treatment groups

圖5 (a) 暴露21 d后不同濃度處理組在屬水平上腸道菌群的組成變化(不同顏色代表不同的菌屬)；(b) 不同處理后最豐富的6個(gè)屬的Kruskal-Wallis分析檢驗(yàn)Fig.5 (a) Changes in the gut microbiota composition at the genus level after LC/PDA-MS exposure for 21 days (each colour represents one bacterial genus);(b) Kruskal-Wallis test of the most abundant six genus in different treatment groups

3 討 論

免疫系統(tǒng)是保護(hù)機(jī)體免受外界刺激的主要機(jī)制之一[18].中華絨螯蟹作為甲殼動(dòng)物，與其他無(wú)脊椎動(dòng)物一樣缺乏完善的免疫系統(tǒng)，而是依賴于先天性免疫系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì)各種外界刺激[19]，先天性免疫系統(tǒng)主要包括酚氧化酶系統(tǒng)、抗菌肽、溶菌酶等，許多研究從基因角度探究機(jī)體應(yīng)對(duì)外界刺激的免疫情況.

抗菌肽是甲殼動(dòng)物先天性免疫重要的組成部分，是抵御病原體的第一道防線，Crustin是重要的效應(yīng)分子之一[20].在本研究中，Crustin基因在肝胰腺和血細(xì)胞中呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，表明低濃度LC/PDA-MS會(huì)刺激機(jī)體對(duì)外界環(huán)境脅迫做出反應(yīng)，然而隨著濃度的增加，血細(xì)胞中Crustin基因表達(dá)量逐漸降低.有研究表明，中華絨螯蟹在氨氮脅迫之后會(huì)抑制Crustin基因表達(dá)[21]；缺氧會(huì)抑制斑節(jié)對(duì)蝦甲殼素基因的表達(dá)[22]，可能高濃度的LC/PDA-MS會(huì)抑制Crustin表達(dá)進(jìn)而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生負(fù)面影響.

溶菌酶是一種作用于細(xì)胞壁的特殊水解酶，也是重要的先天免疫因子，甲殼動(dòng)物可通過調(diào)節(jié)溶菌酶基因的表達(dá)來(lái)提高抗病能力[23].結(jié)果表明，在血細(xì)胞中，溶菌酶的表達(dá)先增加后減少，說(shuō)明溶菌酶在抵御外界刺激方面起著重要作用，隨著LC/PDA-MS濃度的升高，LZM的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，這可能是由于高濃度懸浮液抑制了溶菌酶的轉(zhuǎn)錄.無(wú)論在血細(xì)胞還是肝胰腺中，空白懸浮液組的溶菌酶表達(dá)均高于對(duì)照組，推測(cè)空白懸浮液處理組能刺激溶菌酶基因表達(dá)，提高機(jī)體應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的能力.以往的研究表明，溶菌酶是反映環(huán)境污染的指標(biāo).肝臟中溶菌酶基因表達(dá)量高于血細(xì)胞，而0.60 mg/L LC/PDA-MS處理組血細(xì)胞的表達(dá)低于對(duì)照組，可能是由于血細(xì)胞首先接觸到納米農(nóng)藥，最先受到影響.

Propo是無(wú)脊椎動(dòng)物的主要免疫反應(yīng)蛋白之一，它需要通過絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)激活，由PPAF介導(dǎo)[24-25].在本研究中，PPAF的表達(dá)水平隨著肝胰腺中濃度的增加而增加，這表現(xiàn)在Propo表達(dá)水平的增加.實(shí)驗(yàn)結(jié)果和中華絨螯蟹對(duì)全氟辛烷磺酸鈉的暴露結(jié)果一致[26].肝胰腺對(duì)LC/PDA-MS更敏感，可能與肝胰腺解毒功能有關(guān).本研究發(fā)現(xiàn)，第14天血細(xì)胞中PPAF基因表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，而Propo表達(dá)水平不受限制，推測(cè)血細(xì)胞釋放Propo不受PPAF影響，有研究證明細(xì)菌感染可以刺激細(xì)胞中酚氧化酶的釋放[27].

細(xì)胞凋亡是應(yīng)對(duì)機(jī)體炎癥的重要反應(yīng)，機(jī)體可通過細(xì)胞凋亡減少外界對(duì)細(xì)胞的損傷，Caspase是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要基因[28].在本研究中，Caspase基因在血細(xì)胞中7 d、14 d時(shí)上調(diào)，說(shuō)明機(jī)體可通過調(diào)節(jié)基因來(lái)維持機(jī)體穩(wěn)態(tài).然而，在21天Caspase基因表達(dá)下調(diào)，可能是機(jī)體產(chǎn)生了炎癥反應(yīng).myD88是Toll通路中重要的蛋白，有研究指出，機(jī)體可通過加快Toll通路中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)提高免疫力[29].在7天時(shí)，血細(xì)胞中myD88基因上調(diào)，機(jī)體可通過提高基因表達(dá)提高其傳遞信號(hào)的能力，然而高濃度的農(nóng)藥會(huì)降低其表達(dá)，進(jìn)而會(huì)影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后降低了機(jī)體的抵抗力.以上血細(xì)胞和肝胰腺免疫相關(guān)基因的表達(dá)隨著濃度的升高呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，存在“毒性興奮效應(yīng)”.

動(dòng)物腸道是重要的消化、食物儲(chǔ)存、養(yǎng)分吸收的重要器官，穩(wěn)定的腸道菌群對(duì)于宿主的健康起到非常重要的作用[30-31].已有研究表明，生物在應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)會(huì)對(duì)群落結(jié)構(gòu)造成一定影響，例如南美白對(duì)蝦在暴露于硫化物之后腸道群落會(huì)發(fā)生變化[32]，然而，生物在暴露于納米農(nóng)藥后對(duì)腸道菌群的研究卻很少.本研究對(duì)中華絨螯蟹V3～V4可變區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行高通量測(cè)序.研究發(fā)現(xiàn)，在3個(gè)處理組中，有166個(gè)OTUs相同，從Simpson指數(shù)，Chao1指數(shù)得出處理組與對(duì)照組在腸道菌群豐度和多樣性指數(shù)無(wú)顯著差異，這說(shuō)明腸道菌群在生物體內(nèi)有一定的穩(wěn)定性.在本研究中，其腸道主要的菌群為變形菌門、擬桿菌門、軟壁菌門、厚壁菌門和放線菌門，這與中華絨螯蟹暴露于草甘膦、微塑料后的菌群一致[28,33].各處理組在群落組成上有一定的相似性，但也存在一定的差異，處理組增加了擬桿菌門的豐度，擬桿菌門寄生于胃腸道，可以分解多糖等大分子物質(zhì)，因此對(duì)于機(jī)體的消化功能有重要的作用[34].通過對(duì)中華絨螯蟹腸道菌群門水平的分析，在納米農(nóng)藥處理后可能對(duì)腸道菌群的平衡有一定影響，對(duì)中華絨螯蟹消化多糖的能力無(wú)明顯影響.

基于屬水平分析，空白懸浮劑組中希瓦氏菌屬，氣單孢菌屬降低，黃桿菌屬比例上升.希瓦氏菌屬能產(chǎn)生有害的化學(xué)物質(zhì)，是引起腐敗的主要細(xì)菌[35]；氣單孢菌是常見的病原體，具有較強(qiáng)的致病性[36]；黃桿菌屬是擬桿菌門中分解多糖的好氧有機(jī)體.以上研究表明中華絨螯蟹在空白懸浮劑組處理后可改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，0.60 mg/L LC/PDA-MS處理組和空白懸浮劑組處理后對(duì)腸道平衡造成影響.目前對(duì)甲殼動(dòng)物腸道菌群的研究相對(duì)較少，因此需要進(jìn)一步研究確定納米農(nóng)藥處理對(duì)腸道菌群的影響.

4 結(jié) 論

本研究首次系統(tǒng)研究了不同濃度納米農(nóng)藥LC/PDA-MS及空白懸浮劑對(duì)中華絨螯蟹在7 d、14 d、21 d實(shí)驗(yàn)藥物暴露后，肝胰腺和血細(xì)胞中免疫相關(guān)基因的表達(dá)量及腸道菌群分布的變化.研究結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，免疫相關(guān)基因表達(dá)水平總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；在低濃度LC/PDA-MS實(shí)驗(yàn)組及空白懸浮劑組，實(shí)驗(yàn)組對(duì)免疫相關(guān)基因具有免疫刺激作用，通過免疫因子表達(dá)量的增加，提高機(jī)體免疫能力，應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化.另外，在針對(duì)腸道微生物富集豐度的研究中，0.60 mg/L LC/PDA-MS處理組和空白懸浮劑中擬桿菌門豐度增加，希瓦氏菌屬豐度增加、氣單胞菌屬豐度下降，以上結(jié)果說(shuō)明納米農(nóng)藥可改變腸道菌群的分布，進(jìn)而對(duì)機(jī)體免疫造成一定影響.空白懸浮劑對(duì)免疫基因較對(duì)照組升高或與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明空白懸浮劑組對(duì)中華絨螯蟹影響較小.LC/PDA-MS納米農(nóng)藥對(duì)中華絨螯蟹生長(zhǎng)與發(fā)育影響的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究.