尚凌月，楊 熙，王穎忱，張 鋒,3，張曉金,3，吳燕華,4

(1. 復旦大學 生命科學學院，上海 200433； 2. 復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，上海 200011； 3. 上海市女性生殖內(nèi)分泌相關疾病重點實驗室，上海 200011； 4. 生物科學國家級實驗教學示范中心(復旦大學)，上海 200433)

早發(fā)性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency， POI)，是一種常見的女性生殖系統(tǒng)疾病，指女性40歲以前出現(xiàn)卵巢功能減退，主要表現(xiàn)為閉經(jīng)或者月經(jīng)稀發(fā)，促性腺激素水平升高和雌激素水平下降[1]，還常伴有不同程度的潮熱盜汗、煩躁易怒等圍絕經(jīng)期癥狀.

既往研究發(fā)現(xiàn)，40歲以前的女性中約有1%面臨POI的困擾[2].由于卵巢功能過早衰竭，POI患者不僅面臨生育困境，還會出現(xiàn)繼發(fā)性的多種全身性慢性疾病[3].POI的病因十分復雜，且大部分POI患者病因尚未明確，病毒感染、醫(yī)源性損傷(如手術、放療化療等)、藥物影響、自身免疫缺陷、環(huán)境因素以及遺傳因素等，都可能導致POI.以往的臨床研究發(fā)現(xiàn)，遺傳致病因素占POI病因的20%～25%，在POI的病因學研究中占有重要地位[4].

已有的POI遺傳病因研究揭示了一些可能致病的核型異常以及單基因變異.例如，目前普遍認為染色體異常是POI的常見病因，包括X染色體數(shù)量異常、X染色體結構異常、常染色體結構異常[3].又如，脆性X綜合征相關致病基因FMR1前突變提高POI致病風險[4-7].已報道的可導致POI的單基因遺傳變異涉及約60余個基因，患者表型包括綜合征型的POI和非綜合征型POI.例如BLM[5]，CLPP[6-7]，F(xiàn)OXL2[8]等基因的純合致病變異可導致綜合征型POI，除了POI表型外，患者可伴有生長遲緩和胰島素抵抗、聽力受損、或者眼瞼發(fā)育不良等癥狀.又如減數(shù)分裂相關基因DMC1[9]，MCM8[10-11]等的純合致病變異，DNA修復相關基因FANCL[12]、轉錄調(diào)控相關基因FIGLA[13]等的單等位基因致病變異會導致非綜合征型POI.

全外顯子組測序(Whole-Exome Sequencing, WES)技術是一種新穎的高通量二代測序技術，適用于篩選孟德爾疾病及罕見綜合征的致病基因.近年來WES在POI的遺傳病因分析中也發(fā)揮了重要作用.利用WES技術，在POI家系以及散發(fā)患者中已經(jīng)鑒定出多個新穎的POI致病基因，例如STAG3，SYCE1，SPIDR，HFM1等[2].但是目前臨床上仍有半數(shù)以上的POI患者病因不明.

本研究利用WES技術以及遺傳分析在中國漢族POI患者隊列中篩查候選致病變異，發(fā)現(xiàn)了一例攜帶ATG7c.1372G>A(p.V458M)突變的患者.由以往研究可知，ATG7基因缺陷與POI表型關系密切[14-15]，提示本研究發(fā)現(xiàn)的ATG7新發(fā)突變很有可能是該POI患者的病因.本研究進一步通過Sanger測序、家系回訪和生物信息學分析等方法深入探究了該突變致病的可能性.

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究的研究對象由復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院收集.入組POI患者的標準是： (1) 年齡小于40歲的女性出現(xiàn)≥4個月的月經(jīng)稀發(fā)或者閉經(jīng)現(xiàn)象；(2) 至少兩次，且時間間隔>4周的血清基礎卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone, FSH)>25 IU/L[1]；(3) 無染色體變異、自身免疫病、醫(yī)源性損傷、腮腺炎病史、環(huán)境風險因素影響等.本研究通過了復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會批準(2017-19)，患者在了解本研究并自愿簽署知情同意書后入組.

1.2 基因組DNA(genome DNA, gDNA)提取

使用QIAamp?DNA Blood Mini Kit(QIAGEN，德國)，從患者的外周血中提取gDNA，之后利用Nanodrop儀器測定其濃度和純度，以及通過瓊脂糖凝膠電泳評估抽提的gDNA質量.

1.3 WES及測序結果比對

gDNA樣品的WES由艾吉泰康生物科技(北京)有限公司完成.以gDNA為材料構建文庫，使用Hiseq X-Ten平臺(Illumina，美國)進行測序.在過濾低質量數(shù)據(jù)后，與參考基因組GRCh37/hg19(2009)進行比對，識別遺傳變異位點并進行注釋，獲得所有捕獲區(qū)域的遺傳變異信息.

1.4 Sanger測序驗證

篩選WES結果得到的候選遺傳變異，首先根據(jù)其在基因組上的位置，通過UCSC網(wǎng)站(https：∥genome.ucsc.edu)獲取其上下游序列，以之為模板設計引物，引物應能擴增出包含待驗證變異位點在內(nèi)的、長度在200～1 000 bp之間的PCR產(chǎn)物.引物正向序列為ATGTCTCTGTTTGCTGCCCT，反向序列為TGGCACTATGCTACCAGGTC.使用Golden Star T6 Super PCR Mix(擎科，中國)試劑，通過PCR擴增目的片段.經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen，美國)凝膠回收PCR產(chǎn)物，隨后對產(chǎn)物進行Sanger測序，并使用SnapGene軟件查看分析測序結果.

1.5 生物信息學分析

利用SWISS -MODEL網(wǎng)站[16](https：∥swissmodel.expasy.org)模擬蛋白質高級結構.利用PSIPRED網(wǎng)站[17](http：∥bioinf.cs.ucl.ac.uk/introduction/)預測蛋白的二級結構.

2 結 果

2.1 POI患者的臨床病理信息

本研究的POI患者1997年出生，初潮年齡是12歲，初潮后的幾年月經(jīng)規(guī)律，月經(jīng)周期為28～31 d，經(jīng)期4 d，經(jīng)量偏少.患者從2016年開始出現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)的情況，無其他既往病史，2018年7月27日測得FSH水平為86.51 IU/L，2018年10月12日測得FSH水平為128.39 IU/L，兩次連續(xù)測量水平高于40 IU/L，被診斷為POI.2018年11月20日B超檢查其雙側卵巢偏小，且未發(fā)現(xiàn)明顯卵泡.詳細的臨床信息如表1所示.核型分析顯示患者的染色體數(shù)目和結構均無異常.該患者為獨生女，父母均體格健康，且母親月經(jīng)規(guī)律，目前年齡46歲，未絕經(jīng).

表1 攜帶ATG7突變的POI患者臨床病理信息

2.2 WES與遺傳變異分析

從患者外周血提取的gDNA，經(jīng)Nanodrop分析，其濃度大于50 ng/μL，吸光度A260/A280在1.8～2.0之間，A260/A230>1.9，質量較高.瓊脂糖凝膠電泳顯示gDNA的濃度和條帶大小適宜，可用于WES.

WES測序結果經(jīng)序列比對后，共獲得150 709個遺傳變異，包括單核苷酸變異(Single Nucleotide Variants, SNVs)和短插入缺失(Insertion-Deletion, InDel).我們設計了POI患者WES測序結果的分析流程，對原始數(shù)據(jù)進行質量評估后再進行遺傳變異篩選，表2顯示了具體的篩選流程以及每一步篩選后保留的遺傳變異數(shù).具體來說，首先對WES獲得的所有遺傳變異進行質量評估.其次，去除位于內(nèi)含子或者距離剪切區(qū)域15 bp以外的變異.第三，因為POI的發(fā)病率為1%，遺傳因素占POI病因的20%～25%，且具有高度異質性，所以本研究中最小等位基因頻率(Minor Allele Frequency, MAF)篩選閾值選擇為1‰，即保留在千人基因組數(shù)據(jù)庫(1 000 Genome，1KG)[18]、ExAC和gnomAD[19]3個數(shù)據(jù)庫中東亞人群頻率均小于1‰的變異.第四，根據(jù)突變類型的不同進行有害性評估.篩去同義SNVs；通過SIFT[20]、PolyPhen-2[21]、MutationTaster[22]、CADD[23]4種算法預測錯義SNVs的有害性，保留4種軟件均認為有害的SNVs；直接保留其他功能喪失型突變，包括無義突變、終止密碼子丟失、移碼或者非移碼的InDel以及剪切位點變異.最終得到39個候選的致病性遺傳變異(表2)及相應基因.

表2 WES數(shù)據(jù)篩選流程及結果

對39個候選基因及變異進行文獻調(diào)研，包括POI患者的臨床報道、動物模型和該基因的功能實驗，綜合評估每個遺傳變異的致病可能性.最終發(fā)現(xiàn)一個已知POI致病基因的新變異，即ATG7 c.1372G>A(p.V458M)(表3).ATG7，即自噬相關基因7(autophagy-related 7)，參與細胞自噬調(diào)節(jié).已有的小鼠模型研究表明條件性敲除ATG7導致小鼠生育力下降[14]，此外ATG7的雜合錯義突變可能誘發(fā)POI[15].綜合前人的研究，我們認為本研究發(fā)現(xiàn)的ATG7雜合錯義突變很可能也是該位患者的遺傳學病因.

表3 一例POI病人中發(fā)現(xiàn)的ATG7突變的信息

1)ATG7的GenBank轉錄本編號是NM_006395；2) 等位基因頻率指突變的等位基因在1KG Project、ExAC和gnomAD數(shù)據(jù)庫東亞人群中的頻率；3) 利用SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster和CADD 4個軟件評估突變的功能.

2.3 ATG7雜合錯義變異的驗證

為排除WES結果假陽性，我們利用Sanger測序進行變異驗證.針對突變位點，我們設計了用于Sanger測序的引物，確定發(fā)現(xiàn)的ATG7的突變是真實存在的變異，測序結果如圖1(a)(見第440頁)所示.進一步通過回訪獲得其父母樣本進行測序，確定父母的基因型.結果發(fā)現(xiàn)患者攜帶的ATG7變異是新發(fā)變異，健康父母均未攜帶該變異(圖1(b)，見第440頁).根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學和基因組學會(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)發(fā)布的序列變異解讀標準與指南[24]，參考其中對于致病或可能致病的變異分類的標準進行評分，4種生物信息學功能預測軟件均預測該變異有害，該變異在東亞人群數(shù)據(jù)庫中缺失.患者攜帶的變異為新發(fā)變異，父母不攜帶該變異且表型健康，共計符合1個支持(PP3)和2個中等(PM2、PM6)的致病性證據(jù)標準，該變異屬于可能致病(likely pathogenic).

圖1 POI患者以及其父母ATG7基因型Fig.1 The ATG7 genotype of the POI proband and her pedigree(a) ATG7基因的Sanger測序.WT為野生型，M為c.1372G>A突變型，箭頭指向突變位點.(b) POI患者家系圖.實心圓圈表示POI患者，黑色箭頭指向先證者，空心圓圈表示正常女性，空心方塊表示正常男性.

2.4 變異位點的有害性分析

我們進一步結合生物信息學手段在蛋白質水平評估ATG7基因c.1372G>A(p.V458M)的有害性.首先，變異改變的氨基酸位點在斑馬魚、雞、哺乳動物等中均保守(圖2(a)).其次，利用SWISS -MODEL模擬構建ATG7蛋白的三維結構，發(fā)現(xiàn)p.V458M變異位于其α-螺旋的位置(圖2(b))；利用PSIPRED 4.0預測蛋白質二級結構發(fā)現(xiàn)，p.V458M變異位于α-螺旋形成起始部位(圖2(c))，可能對于其α-螺旋的形成具有重要作用.第三，變異氨基酸位點同報道的POI致病性ATG7變異c.1209T>A(p.F403L)相近，都位于蛋白保守的E1-like區(qū)域(圖2(d))，該區(qū)域可能起源于古老的原核生物合成途徑，ATG7利用該區(qū)域作為支架形成同源二聚體[25-26].

圖2 ATG7變異分析Fig.2 Genetic analysis of the ATG7 variant(a) 突變位點保守性分析.紅色V表示錯義突變的位點所在氨基酸.(b) 突變位點在蛋白模型中的位置分析.紅框以及放大區(qū)域表示出突變位點對應氨基酸所在的位置.(c) 突變所在位置的二級結構分析.紅框標出突變所在位置.藍色方框表示預測的可信度，顏色越深可信度越高.(d) 突變位點所在基因組及蛋白質結構域位置分析.橙色箭頭指向已報道的突變位點，藍色箭頭指向本研究所報道的突變位點.藍色方框為蛋白質的E1-like區(qū)域，包括354～510位氨基酸.

3 討 論

卵巢是女性生殖系統(tǒng)的性腺，是卵細胞發(fā)育的場所，具有生殖和內(nèi)分泌的重要功能.人類女性在出生前后，卵巢中的每個初級卵母細胞均被單層扁平上皮細胞包圍，形成相互獨立的始基卵泡(primordial follicle)，它們構成了女性一生的生殖儲備池.進入青春期后，每個月會有15～20個左右的始基卵泡被激活，卵母細胞重新啟動減數(shù)分裂，優(yōu)勢卵泡發(fā)育成熟并排卵.卵巢儲備池中的卵泡數(shù)量隨著女性年齡的增加而不斷下降，直至完全耗竭，女性會發(fā)生自然閉經(jīng)[27].POI嚴重影響了女性的生理周期和生育力，如果患者患病較早，甚至可能不育[28].揭示POI病因對于保護女性健康，減少對生育力的威脅具有重要意義.本研究通過WES技術對POI患者的遺傳病因進行探索，發(fā)現(xiàn)一位攜帶ATG7基因雜合c.1372G>A(p.V458M)突變的患者.結合以往ATG7和POI的臨床報道和動物模型研究，以及對變異位點進行一代測序和生物信息學分析后，我們認為篩選得到的ATG7變異很可能是該患者的致病原因.

自噬以及構成自噬核心機制的蛋白質成分從酵母到哺乳動物中都是高度保守的.細胞自噬主要有3種形式： 巨自噬(macroautophagy，自噬的最主要形式，以下簡稱自噬)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy)[29].哺乳動物自噬核心途徑起始于雙層膜結構的吞噬泡的形成，至少有5組蛋白分子參與其中，包括： (1) Atg1/ULK(unc-51-like)激酶復合物；(2) Beclin1/PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)復合物；(3) 兩種跨膜蛋白Atg9和VMP1(vacuole membrane protein 1);(4) 兩個泛素樣結合系統(tǒng)Atg12和Atg8/LC3；(5) 介導自噬體和溶酶體融合的蛋白.其中Atg7參與兩個泛素樣結合系統(tǒng)，該系統(tǒng)是吞噬泡擴展延伸所必須的[30].Atg7是非經(jīng)典的同源二聚體E1酶(E1 enzyme)，可與非經(jīng)典的E2酶Atg3相互作用，在自噬過程中介導泛素樣蛋白Atg8的結合從Atg7轉移到Atg3，在這個過程中Atg8依次被Atg7和Atg3激活[25,31].

2019年，Delcour等在高加索人群散發(fā)性POI樣本中分別發(fā)現(xiàn)了自噬相關基因ATG7和ATG9A的雜合錯義突變各1例，功能研究進一步發(fā)現(xiàn)錯義突變導致了細胞自噬能力下降，是誘發(fā)POI的可能遺傳機制[15].此外，早期研究顯示一些自噬相關基因的純合缺失小鼠無法存活.例如，Atg7純合缺失的小鼠在出生后一天內(nèi)死亡[32]；Beclin1純合缺失小鼠在胚胎期就已經(jīng)死亡[33].2011年Gawriluk等[34]發(fā)現(xiàn)卵巢自噬功能受損會影響卵母細胞的存活，具體表現(xiàn)為出生一天后，Beclin1雜合敲除小鼠卵巢的生殖細胞比對照組減少了56%，而Atg7純合缺失小鼠卵巢在這一時期亦沒有可辨認的生殖細胞[34].這些工作提示了自噬基因與雌性生育力之間的潛在聯(lián)系.2015年Song等[14]在雌性小鼠的生殖細胞中特異性敲除Atg7，小鼠產(chǎn)仔數(shù)比對照組減少了約63%，并且發(fā)現(xiàn)這種小鼠第一胎可育且產(chǎn)仔數(shù)與對照組無明顯差異，但是隨后每窩產(chǎn)仔數(shù)突然減少或變得完全不育.組織學研究發(fā)現(xiàn)，雖然在受精后17.5天時條件性敲除Atg7小鼠與對照組的卵母細胞數(shù)量無明顯差異，但是在出生3天后觀察到卵母細胞的過度丟失，表明自噬可能是新生兒期生殖細胞存活所必需的.經(jīng)過體外模擬新生兒卵巢發(fā)育過程，該研究還表明自噬機制正確調(diào)控可減少卵巢生殖細胞過度丟失.哺乳動物新生兒出生后即面臨嚴重的饑餓狀態(tài)，此時器官會誘導自噬、通過自體蛋白的降解來生產(chǎn)氨基酸，以維持能量穩(wěn)態(tài)[35].在小鼠饑餓模型中進一步發(fā)現(xiàn)，對新生小鼠進行饑餓處理會誘導卵巢中卵母細胞自噬水平上升，卵母細胞和體細胞凋亡增加，延遲始基卵泡池的建立[36].由此推測，哺乳動物出生時可能需要正常的自噬功能幫助克服早期的饑餓階段，也從而保護卵母細胞出現(xiàn)過度丟失.

本研究發(fā)現(xiàn)的雜合ATG7變異屬于新發(fā)突變，有兩種可能的遺傳模式： 單倍體不足或者突變的顯性負作用.錯義突變可能會影響蛋白質表達水平或mRNA穩(wěn)定性，從而導致單倍體不足.另一方面，因為ATG7發(fā)揮功能需要形成同源二聚體[25-26]，而p.V458M變異位于α-螺旋的關鍵位置，可能影響二聚體的形成與功能，發(fā)揮顯性負效應.進一步的遺傳模式分析還有賴于深入的分子生物學實驗.

綜上，本研究在一位中國漢族POI患者中鑒定出一個ATG7雜合錯義變異.這是迄今為止在POI患者中發(fā)現(xiàn)的第二個致病性ATG7遺傳變異，再次提示了自噬對于女性卵巢儲備的重要性，并豐富了POI的遺傳病因.