楊湘，馬鵬，馮俊

(南充市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川 南充 637000)

喉癌是臨床較常見的咽喉惡性腫瘤，發(fā)生率占全身惡性腫瘤的5%～7%，且有侵襲能力強(qiáng)、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著患者身心健康[1]。早期喉癌采用手術(shù)、放化療、基因療法等綜合手段進(jìn)行治療，可獲得較好的療效，但大多數(shù)患者在確診時(shí)病情已進(jìn)展到中晚期，療效欠佳。因此，了解喉癌的生長、轉(zhuǎn)移機(jī)制，及早確診對于患者治療及預(yù)后改善具有重要的意義。近年來，隨著喉癌發(fā)生率逐漸升高，惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制引起學(xué)者的重視。TOLL樣受體(TLRs)是核因子κB(NF-κB)的潛在激活劑，已有大量研究證實(shí)其是炎癥病變與惡性腫瘤發(fā)生間的橋梁[2]，在胰腺癌、肺癌中呈高表達(dá)[3]。轉(zhuǎn)錄因子21(TCF21)屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)蛋白家族成員之一，對促進(jìn)細(xì)胞生長、分化具有一定的調(diào)控作用，當(dāng)前已被證實(shí)其在肺癌、乳腺癌、腎癌等多種癌癥中可作為抑癌基因參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[4]。然而，關(guān)于TLR4、TCF21在喉癌中的具體表達(dá)情況及其臨床意義、相關(guān)機(jī)制等仍未明確。本研究旨在探究TLR4 mRNA、TCF21 mRNA在喉癌組織中的表達(dá)情況，初步分析潛在機(jī)制，為喉癌的臨床診斷及治療提供新依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2018年11月至2020年6月南充市中心醫(yī)院收治的95例喉癌患者為研究對象，術(shù)前均完善頸部增強(qiáng)CT、電子纖維喉鏡、病理活檢確診為喉鱗狀細(xì)胞癌，且在手術(shù)前未接受過放化療。其中男性86例，女性9例；年齡45～76歲，平均(58.09±7.55)歲；癌癥位置：聲門型59例，聲門上型30例，聲門下型6例；組織學(xué)分化：低分化40例，中分化29例，高分化26例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：N037例，N136例，N222例；浸潤深度：T1～269例，T3～426例；臨床分期：Ⅰ期41例，Ⅱ期34例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例。在手術(shù)過程中，留取喉癌組織以及距離喉癌3～6 cm的癌旁正常組織作為實(shí)驗(yàn)樣本，樣本取出后迅速將其存放到裝有RNALATER溶液的凍存管中中，在-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 PCR擴(kuò)增儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；微量高速離心機(jī)(上海錦玟儀器設(shè)備有限公司)；可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)。TRIzon總RNA提取試劑(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；TCF21、TLR4引物序列(上海英駿生物技術(shù)有限公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒(上海烜雅生物科技有限公司)；invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京優(yōu)尼康生物有限公司)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)。

1.2.2 TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表達(dá)水平測定 采用RT-PCR技術(shù)，具體如下：(1)總RNA提?。禾崛颖窘M織中的中RNA，嚴(yán)格按照TRIzon總RNA提取試劑說明書進(jìn)行操作。取2 μL RNA樣本，用SP-723/723 PC可見分光光度計(jì)在260 nm下的吸光度測定定量樣本組織中定量RNA濃度。檢測RNA在260 nm、280 nm下的吸光度分析RNA純度測定，記錄OD260/OD280，所有樣本的OD260/OD280比值要求為1.7～2.0，低于此必須提示提取的RNA含有蛋白質(zhì)雜志，需應(yīng)用氯仿重新提純。同時(shí)應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。(2)cDNA合成：以總RNA作為模板，應(yīng)用invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。取0.2 mL經(jīng)DEPC處理過的PCR管，冰浴條件下在PCR管內(nèi)配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。(3)RT-qPCR反應(yīng)：按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行TLR4和TCF21引物合成操作。在PCR管內(nèi)依次加入：1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，基因上游與下游引物各0.25 μL，PCR反應(yīng)mix12.5 μL，并加入ddH2O是管內(nèi)溶液體積達(dá)到25 μL?；靹騊CR管內(nèi)溶液，將其置于PCR儀中按照反應(yīng)條件(95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 45 s，共28個(gè)循環(huán))完成RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將樣品存放到-20℃冰箱中備用。內(nèi)參GAPDH引物(擴(kuò)增片段116 bp)，上游序列：5′-CTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA-3′,下游序列：5′-ATG ATC TTG AGG CTG TTG TCA TA-3′；TLR4引物(擴(kuò)增片段356 bp)，上游序列TLR4：5′-GCC GGA AAG TTA TTG TGG TGG T-3′，下游序列：5′-ATG GGT TTT AGG CGC AGA GTT T-3′；TCF21引物(擴(kuò)增片段127bp)，上游序列：5′-TGC GTT CGC TAC ATA CAA GGT G-3′，下游序列：5′-TCT GTG ACT TGG CGT CTC GG-3′。(4)計(jì)算TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表達(dá)水平：同一樣本不同基因在不同PCR管中機(jī)械能，擴(kuò)增后對擴(kuò)增曲線、溶解曲線進(jìn)行分析，獲得循環(huán)閾值(CT值)，最后通過2-△△Ct法計(jì)算TLR4 mRNA、TCF21 mRNA在喉癌組織內(nèi)相對表達(dá)水平(△△Ct值=喉癌組織△Ct(目的基因)-癌旁組織△Ct(目的基因，△Ct值=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)喉癌組織、癌旁組織中TLR4 mRNA、TCF21mRNA表達(dá)水平；(2)TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表達(dá)水平與喉癌患者組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期、病理特征、浸潤深度等臨床病理特征的關(guān)系。(3)喉癌組織中TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 喉癌組織與癌旁組織TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表達(dá)水平比較

喉癌組織的TLR4 mRNA表達(dá)水平高于癌旁正常組織(P<0.05)，而喉癌組織TCF21 mRNA表達(dá)水平較癌旁正常組織降低(P<0.05)。見表1。

表1 喉癌組織與癌旁組織TLR4、TCF21mRNA表達(dá)水平比較

2.2 喉癌組織不同病理特征TLR4、TCF21mRNA表達(dá)水平比較

在喉癌組織中，TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表達(dá)水平與癌組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在病灶位置、腫瘤大小、病理形態(tài)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 喉癌組織不同病理特征TLR4、TCF21mRNA表達(dá)水平比較

2.3 喉癌組織中TLR4 mRNA、TCF21m RNA表達(dá)水平與各種病理特征的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，喉癌組織中TLR4 mRNA表達(dá)水平與癌組織分化程度呈負(fù)相關(guān)，與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)(P<0.05)；TCF21 mRNA表達(dá)水平與組織分化程度呈正相關(guān)，與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；癌組織的TLR4 mRNA表達(dá)水平與TCF21 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.454，P<0.001)。見表3。

表3 喉癌組織中TLR4、TCF21mRNA表達(dá)水平與各種病理特征的相關(guān)性

3 討論

在臨床上，早期喉癌容易被漏診，但此階段的病灶經(jīng)手術(shù)、放化療治療后往往會達(dá)到臨床治愈的標(biāo)準(zhǔn)，而中晚期喉癌雖易確診，但患者即使進(jìn)行綜合手段治療后仍會有呼吸、吞咽、發(fā)音功能障礙等問題，使其生存率、生存質(zhì)量嚴(yán)重降低[5]。因此，早期診斷早治療至關(guān)重要。當(dāng)前，關(guān)于喉癌病因的相關(guān)研究報(bào)道較多，但其分子機(jī)制尚無明確的研究結(jié)果，而且針對喉癌的基因療法、靶向治療效果仍有效，故在分子水平上對喉癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制進(jìn)行研究為臨床熱門話題，能夠在一定程度上提升喉癌的診治水平[6]。

文獻(xiàn)報(bào)道[7]慢性炎癥可顯著升高癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，Toll樣受體(TLR)家族為參與非特異性免疫的模式識別受體，其能夠介導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)、慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展而且對腫瘤生物學(xué)特性也有一定的影響[8]。TLR4為Ⅰ型跨膜蛋白受體，定位于17號染色體，TLR4在前炎性因子與特異性配體結(jié)合后可被激活，使TLR4信號傳導(dǎo)至下游通路，促使炎癥反應(yīng)發(fā)生，與此同時(shí)也能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化[9]。大量研究證實(shí)TLR4可經(jīng)過多種方式參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展[10]。相關(guān)研究[11]指出，炎性配體可通過TLR4信號通路使體內(nèi)的NF-κB被激活，進(jìn)而參與炎癥發(fā)展為腫瘤這一病理過程。Galle等[12]研究顯示，HSP70 1A蛋白為炎癥的內(nèi)生性配體之一，其能夠促使癌細(xì)胞的TLR4表達(dá)水平升高，釋放大量HMGB1物質(zhì)，進(jìn)而通過TLR4通過激活NF-κB，增強(qiáng)Hep-2喉癌細(xì)胞凋亡抵抗性，促使癌細(xì)胞增殖分化。本研究結(jié)果顯示，喉癌組織中的TLR4 mRNA表達(dá)水平較癌旁正常組織要高(P<0.05)，且其表達(dá)水平與癌組織分化程度呈負(fù)相關(guān)，與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)(P<0.05)，可能與TLR4與自身配體結(jié)合后產(chǎn)生的一系列級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。TLR4可通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(如髓樣分化因子88依賴途徑和非依賴途徑)，上調(diào)抗原遞呈細(xì)胞，激活特異性免疫應(yīng)答，幫助機(jī)體抵抗病原微生物的感染和修復(fù)損傷的組織，但是當(dāng)TLR4傳導(dǎo)通路持續(xù)或異?；罨赡軙閷?dǎo)炎癥通路，引起炎癥反應(yīng)，促使腫瘤免疫逃逸。Shyam等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)，TLR4信號通路能夠刺激TNF-α等促炎物質(zhì)大量分泌，進(jìn)而參與到腫瘤新生血管形成，或促使癌細(xì)胞黏附、遷移，導(dǎo)致癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步說明了TLR4 mRNA可能參與喉癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究還發(fā)現(xiàn)喉癌組織的TCF21 mRNA表達(dá)較癌旁組織要低(P<0.05)，且其表達(dá)水平與癌組織分化程度呈正相關(guān)，與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。TCF21為近年新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因中的一種，屬于bHLH家族成員之一，被證實(shí)可影響細(xì)胞增殖、分化等生理過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[14]。Wei等[15]的研究發(fā)現(xiàn)約有80%以上的喉癌患者會出現(xiàn)TCF21甲基化或TCF21表達(dá)下調(diào)，也正式由于其表達(dá)下調(diào)致使細(xì)胞DNA修復(fù)基因的生理功能異常，難以及時(shí)修復(fù)損傷DNA結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞生長分化產(chǎn)生一定抑制作用，進(jìn)而引起抑制細(xì)胞異常增殖的能力有所降低，誘發(fā)癌癥。另有研究[16-17]報(bào)道，過表達(dá)TCF21能夠通過對細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)水平產(chǎn)生調(diào)控作用，進(jìn)而阻止人喉癌細(xì)胞株Hep-2增殖分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，故TCF21可成為喉癌診斷或靶向治療的潛在作用位點(diǎn)。此外，本研究顯示癌組織的TLR4 mRNA表達(dá)水平與TCF21 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.454，P<0.001)，提示TCF21能夠負(fù)性調(diào)節(jié)喉癌組織TLR4表達(dá)，并可抑制細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。

綜上，TLR4高表達(dá)、TCF21低表達(dá)在喉癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，兩者具有一定的相關(guān)性，相互作用可能促進(jìn)喉癌細(xì)胞惡性增殖分化，故檢測TLR4、TCF21表達(dá)水平有望成為喉癌患者病理特征判斷的主要生物學(xué)指標(biāo)，為本病診療提供可靠的依據(jù)。