蘆安娜

摘要：以卷曲霉素產生的菌卷曲鏈霉菌作為出發(fā)菌，經過UV誘變和五氯酚濃縮處理，得到一株效價在7950u/ml左右的營養(yǎng)缺陷型卷曲霉素菌株，再經過EMS誘變處理篩選得到更多突變株和高產菌，整個過程中卷曲霉素的效價都能保持在穩(wěn)定的狀態(tài)。采用單因子實驗與多因子正交實驗進行分析，經過研究確定卷曲霉素菌株N13最佳發(fā)酵條件，此時卷曲霉素效價達到了9483u/ml，比出發(fā)菌的效價提升了42.8%以上。

關鍵詞：卷曲霉素;卷曲鏈霉菌;結核桿菌;發(fā)酵生產;菌種改良

引言：卷曲霉素主要是由卷曲鏈霉菌產生的環(huán)狀多肽類抗生素，對結核桿菌傳染引發(fā)的肺結核有著較好的治療效果，且副作用比較小。目前卷曲霉素已成為較為理想的抗結核菌藥物，由于其發(fā)酵效價成本低，成藥價格略高，有必要對卷曲霉素產生菌進行有效的改良與分析，經過物理或化學誘變劑處理方法做出改良，并得到理想化實驗結果。

1.卷曲霉素的研究現(xiàn)狀

卷曲霉素簡稱CPM，是由卷曲鏈霉菌或指孢囊菌產生，類似于紫霉素的環(huán)狀多肽類抗生素，卷曲霉素中的組份十分相似，可以溶于水，但無法溶于多數(shù)有機溶劑，卷曲霉素在酸堿度4-8的水溶液中比較穩(wěn)定，其抗菌機理是抑制細菌蛋白質的合成。當前人們將卷曲霉素用于抗結核桿菌感染，這是有效控制耐藥性結核疾病的重要抗生素，隨著肺結核抗菌素的研制成功，肺結核已經基本得到控制，但近年來該疾病再次蔓延，世衛(wèi)組織于1993年宣布肺結核為全球性急癥，1996年將4月24日定為世界防治結核病日[1]。

2.卷曲霉素產生菌的改良研究

2.1材料與方法

2.1.1菌株與試劑

卷曲霉素產生菌的改良試驗主要用到兩種菌株，一種是出發(fā)菌株卷曲鏈霉素4006，另一種是檢測菌枯草芽孢桿菌6633，這兩種菌株目前都由中國科學研成都生物所負責保存。

本實驗使用到的方法主要有以下幾種：（1）紫外線誘變篩選。紫外線誘變就是將出發(fā)菌卷曲鏈霉素在高氏一號斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天左右，溫度控制在28℃，使用無菌生理鹽水洗下孢子，再用玻珠搖勻，制作為每毫升106個孢子懸液。取下50ml的孢子懸液，將其放在500ml燒杯內，紫外燈先預熱20min，隨后將燒杯放在磁力攪拌器上，用40w燈在距離30cm的位置照射0-5min，分別取樣10ml即可。等待樣品稀釋取0.1ml稀釋液涂布ES平板，在28℃環(huán)境下避光培養(yǎng)一周即可，測定卷曲霉素紫外誘變后的存活情況。（2）營養(yǎng)缺陷型篩選。使用無菌牙簽將ES平板上長出的菌落分別點中在基礎平板和ES平板中，并與出發(fā)菌4006進行對照分析，每個平板需點中菌落52個，在28℃的環(huán)境溫度下培養(yǎng)10天左右。在基礎平板上不長，但是在ES平板上生長的菌落就是營養(yǎng)缺陷型。（3）CPM抑制卷曲鏈霉菌4006實驗分析。

2.1.2培養(yǎng)基

對于實驗中需要用到的培養(yǎng)基，主要有以下幾種：高氏一號培養(yǎng)基，使用蒸餾水定容后到1L，要求酸堿度在7.2左右;種子培養(yǎng)基，其中包含蛋白、玉米淀粉、葡萄糖、碳酸鈣、氯化鈉、氫氧化鈉等，用蒸餾水定容，酸堿值達到7.2;發(fā)酵培養(yǎng)基，主要用于卷曲霉素初篩和復篩，與種子培養(yǎng)基要求相同;NO.13與NO.39培養(yǎng)基，前者需要將20g的掩埋在1L蒸餾水內煮沸20分鐘，紗布過濾后加入18g瓊脂，補充蒸餾水到1L，調整酸堿值為7.2，再加入1ml微量元素溶液。NO.39培養(yǎng)基中包含葡萄糖、麥芽酚、碳酸鈣、瓊脂以酵母膏，加入蒸餾水后還需使用KOH調整PH值。

2.1.3原生質體NTG誘變

首先，培養(yǎng)菌絲體生長。將出發(fā)菌孢子使用生理鹽水洗下，玻璃珠搖勻后接入盛裝25mlPM1培養(yǎng)液的三角瓶內，要求溫度控制在30℃，每分鐘150r勻速培養(yǎng)24小時。其次，制備原生質體，最終溶菌酶的濃度應達到1g/L，在搖床上保持每分鐘100r的速度，35℃下酶處理60分鐘。最后，NTG誘變原生質體，取10ml離心管，共3支，分別加入4ml原生質體懸液，再加入NTG，洗滌后制作原生質體溶液并涂布在平板上，30℃的溫度下培養(yǎng)一周，最終確定原生質體再生頻率。

2.1.4篩選卷曲霉素高產菌

初步篩選時使用瓊脂塊法，復篩使用搖瓶發(fā)酵法，將斜面上生長好的孢子接種在25ml種子培養(yǎng)液內，在250ml三角瓶中以每分鐘240r的速度培養(yǎng)48小時，種子長好以后再以10%的接種量，將其接種在25ml發(fā)酵培養(yǎng)液內，同等培養(yǎng)條件培養(yǎng)96小時。

2.2研究結果

2.2.1獲得營養(yǎng)缺陷型高產菌

取經過紫外線誘變5分鐘，致死率94%，且經過五氯酚處理后的卷曲霉素孢子懸液涂布在ES平板中，再從菌落中篩選出營養(yǎng)缺陷型4株，經過瓊脂法和搖瓶發(fā)酵的篩選方法，從缺陷型菌株中篩出卷曲霉素效價在7950u/ml的營養(yǎng)缺陷型高產菌，其突變株產量比出發(fā)菌4006產量高出19.7%[2]。

2.2.2獲得抗終產物CPM高產菌

取經過EMS誘變2分鐘且致死率在74%的出發(fā)菌4006的孢子液，涂布在ES平板內，平板中含有CPM，挑取290株CPM突變株，使用瓊脂塊法經過初篩后發(fā)現(xiàn)抑菌圈大于出發(fā)菌，搖瓶發(fā)酵進行復篩，得出抗性突變株5-41，與4006-35株相比產量提高了6.4%。所以抗終產物CPM突變株5-41可以作為下一輪原生質體NTG誘變出發(fā)菌株。

2.2.3NTG誘變原生質體篩選高產菌

再生平板中的原生質體占比92%，使用NTG溶液誘變原生質體30分鐘，篩選出卷曲霉素高產菌，挑選出出高產菌后還需經過初篩與復篩，發(fā)現(xiàn)沒有得到超過出發(fā)菌5-41的菌株，經過NTG誘變CPM抗性突變株原生質體再生菌落內選730株做初篩與復篩，最終得到了9050u/ml突變株N13，與出發(fā)菌5-41相比產量提高了7.2%。

總結：總而言之，當前人們加深了對微生物遺傳學的研究深度，有目的的篩選出了與產品質量和數(shù)量相符合的突變型菌株，避免了以往篩選工作的盲目性。本文采用篩選營養(yǎng)缺陷型突變株的方法得到了卷曲霉素高產突變菌株，在達到卷曲霉素高產菌朱目的的同時為后續(xù)結核菌的抑制奠定了基礎。

參考文獻：

[1]李桂蓮，萬康林.5種中國罕見慢速生長非結核分枝桿菌標準株及臨床分離株的藥物敏感性分析[J].疾病監(jiān)測，2020，35（05）：435-441.

[2]許磊.觀察卷曲霉素在耐多藥肺結核治療中應用價值并分析用藥安全性[J].人人健康，2020（08）：223-224.