郭 茂，陳 琰，李興元，孔德營

遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563000

氰戊菊酯(Fenvalerate，F(xiàn)en)是一種Ⅱ型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，因其具有高效、 低毒、 低殘留等特點，而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和家庭生活中，但其對人類的生殖健康具有明顯的危害性．研究表明，氰戊菊酯是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[1]，具有明顯的雄性生殖毒性，可通過影響睪酮合成相關(guān)酶和蛋白的表達(dá)而影響雄性體內(nèi)睪酮的含量，以及影響支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的功能來干擾下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)作用[2-5]，使雄性生精過程受損，導(dǎo)致精子數(shù)量減少及活力降低．此外，研究表明，雄性體內(nèi)的雌激素對雄性生殖功能也具有重要調(diào)節(jié)作用[6]，氰戊菊酯在干擾睪酮分泌的同時，是否也干擾了雄性體內(nèi)的雌激素分泌以及其受體的表達(dá)從而產(chǎn)生生殖毒性？為了驗證我們的猜想，本研究擬通過分析雌激素及其受體ERβ在Fen染毒后的表達(dá)情況，探討Fen等擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殺蟲劑所致雄性生殖毒性的相關(guān)機制.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑

Fen原藥(純度98.80%)，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司產(chǎn)品； HE染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司； 雌二醇(E2) ELISA試劑盒，上海江萊生物科技有限公司； BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司； CYP19A1，Caspase 3，Caspase 9抗體，英國Abcam公司； ERβ，Bax，Bcl-2抗體，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司； RNA逆轉(zhuǎn)試劑盒和SYBR Premix Ex Taq，日本Takara 公司； TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(增強型綠光)，武漢伊萊瑞特生物科技公司.

1.1.2 儀 器

低溫高速離心機，美國Thermo公司； 分光光度計(ND2000C型)，美國Thermo公司； 酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司； 顯影儀，美國Syngene公司； PCR儀，美國Life Technogies公司； 熒光顯微鏡，日本Olympus公司.

1.2 方 法

1.2.1 實驗動物與處理

體質(zhì)量220～250 g健康性成熟的雄性SD大鼠24只，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(遼)2015-0001．大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機數(shù)表法將大鼠分為對照組(Fen 0 mg/kg)、 低劑量Fen染毒組(20 mg/kg)、 高劑量Fen染毒組(40 mg/kg)，每組8只．染毒組以玉米油溶解配制成不同濃度的Fen溶液等體積灌胃，灌胃量為每100 g體質(zhì)量0.5 mL，每日1次，灌胃前后大鼠自由攝食、 飲水，連續(xù)染毒30 d(大鼠的一個生精上皮周期為12～15 d)，對照組給予等量玉米油．大鼠按12 h白晝的節(jié)律調(diào)節(jié)光照，保持適宜溫度(22±2 ℃)和相對濕度(60%±5%)．連續(xù)染毒30 d后，將大鼠稱質(zhì)量后麻醉，心臟采集血樣，然后迅速分離雙側(cè)附睪和睪丸．采集的血液待其凝固后離心(常溫，1 100 r/min，20 min)，吸取上清液分裝后于-80 ℃保存，用于檢測血清雌激素水平； 分離的附睪和睪丸迅速稱其質(zhì)量，然后用生理鹽水沖洗表面的血污，附睪立即用于精子計數(shù)及活力檢測，右側(cè)睪丸經(jīng)液氮速凍，-80 ℃凍存，用于測定睪丸雌激素水平，檢測CYP19A1，ERβ，Bax，Bcl-2，Caspase 3及Caspase 9 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，左側(cè)睪丸用4%甲醛固定后用于病理結(jié)構(gòu)觀察和生殖細(xì)胞凋亡檢測.

1.2.2 精子計數(shù)、 活力及畸形檢測

參照Kong等[7]的方法并稍作調(diào)整檢測雄鼠附睪精子數(shù)量及活力情況．取單側(cè)附睪尾制備精子懸液，將懸液放入含0.1%牛血清白蛋白的Ham ’s F-12培養(yǎng)基中，放入37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 min，光學(xué)顯微鏡下(400×)計數(shù)400個精子中各級活力(a級：快速直線運動； b級：慢速直線運動； c級：原地打轉(zhuǎn)或運動遲緩； d級：無活動)的精子數(shù)，計算各級精子活力和活動率．于60 ℃水浴中處死精子，用血細(xì)胞計數(shù)法計數(shù)每克附睪中的精子總數(shù)．吸取10 μL精子懸液于載玻片上涂片，涼干，甲醇固定30 min，伊紅染液染色10 min，自來水沖洗玻片，涼干后鏡檢，每個樣本計數(shù)1 000個精子，統(tǒng)計正常與畸形精子數(shù)，計算精子畸形率.

1.2.3 睪丸組織病理形態(tài)學(xué)檢查

取固定于4%甲醛的睪丸組織，經(jīng)梯度乙醇脫水、 浸蠟、 石蠟包埋、 切片(厚4 μm)，每只動物隨機選擇4張切片，經(jīng)HE染色，中性樹膠封片，然后于光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化，如曲細(xì)精管的完整性、 生殖細(xì)胞的數(shù)量等.

1.2.4 血清及睪丸雌二醇(E2)檢測

睪丸組織勻漿制備：用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液PBS(0.01 mol/L，pH值為7.4)沖洗睪丸組織，去除殘留血液，稱質(zhì)量后將組織剪碎．將剪碎的組織按每克的組織樣品加入5 mL的PBS，于冰上充分研磨．最后將勻漿液離心(4 ℃，1 100 r/min，10 min)，取上清分裝后于-80 ℃保存用于檢測．操作步驟嚴(yán)格按照E2 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，取E2標(biāo)準(zhǔn)品、 血清或睪丸組織勻漿加入反應(yīng)孔，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體，37 ℃恒溫箱溫育60 min，洗板，加入反應(yīng)底物，37 ℃恒溫箱避光孵育15 min，加入終止液，測定吸光度(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度.

1.2.5 Real-time PCR法檢測大鼠睪丸CYP19A1，ERβ，Bax，Bcl-2，Caspase 3及Caspase 9的mRNA表達(dá)情況

取-80 ℃凍存的睪丸組織100 mg研磨成粉末狀，然后采用RNAiso-Plus提取試劑提取樣本總RNA，按產(chǎn)品說明書進(jìn)行實驗．采用分光光度計測定總的RNA濃度，根據(jù)光度計260 nm和280 nm處的吸光度比值測定其純度．按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，將所有樣本總RNA濃度調(diào)整為100 ng/μL，取10 μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min； 85 ℃ 5 s； 4 ℃保存．按照Real-time PCR試劑盒說明書要求，取cDNA 2 μL，然后依次加入ddH2O，SYBR Premix Ex Taq(2×)，上下游引物(各引物序列見表1)，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s； 40個PCR循環(huán)(95 ℃ 5 s； 60 ℃ 30 s)．所有反應(yīng)均設(shè)立2個復(fù)孔．記錄每個反應(yīng)管中標(biāo)本的Ct值，以Gapdh為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt法計算各染毒組與對照組的CYP19A1，ERβ，Bax，Bcl-2，Caspase 3及Caspase 9 mRNA的相對表達(dá)量.

表1 引物序列

1.2.6 Western Bolt法檢測大鼠睪丸CYP19A1，ERβ，Bax，Bcl-2，Caspase 3及Caspase 9的蛋白表達(dá)情況

取-80 ℃凍存的睪丸組織60 mg，剪碎后加入裂解液，冰上勻漿并充分裂解30 min，然后離心(4 ℃，13 000 r/min，5 min)，取上清．以BCA法測定總蛋白濃度，每孔以50 μg總蛋白量上樣．12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(120 V，1.5 h)，恒壓轉(zhuǎn)膜(20 V，40～70 min)，室溫封閉2.5 h，4 ℃過夜孵育一抗，室溫孵育二抗1 h，在暗室中用ECL法顯影．目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量用目標(biāo)蛋白的灰度值與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示.

1.2.7 TUNEL法檢測睪丸生殖細(xì)胞凋亡

本研究采用末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測大鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡情況．該技術(shù)的原理是細(xì)胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，剪切核小體間的基因組DNA，暴露出3’-OH，然后暴露的3’-OH可在TdT的催化下加上熒光素-12-脫氧三磷酸腺苷(FITC-12-dUTP)，而后即可通過熒光顯微鏡觀察生殖細(xì)胞的凋亡情況．檢測按試劑盒說明書進(jìn)行，取睪丸石蠟切片(切片制作同睪丸組織病理形態(tài)學(xué)檢查)經(jīng)脫蠟水合，滴加蛋白K酶工作液37 ℃作用25 min，滴加平衡液室溫平衡20 min，滴加TdT酶工作液37 ℃濕盒避光孵育60 min，滴加DAPI室溫避光孵育8 min進(jìn)行染核，甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照，凋亡細(xì)胞呈強綠熒光．TUNEL反應(yīng)陽性細(xì)胞計數(shù)是在熒光顯微鏡下(200×)每張切片隨機選取4個不同視野進(jìn)行計數(shù).

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Fen對大鼠睪丸、 附睪質(zhì)量及體質(zhì)量的影響

如表2所示，與對照組相比，20 mg/kg和40 mg/kg組大鼠睪丸、 附睪質(zhì)量及體質(zhì)量均有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，p>0.05.

表2 Fen對大鼠睪丸、 附睪質(zhì)量及體質(zhì)量的影響

2.2 Fen對雄性SD大鼠附睪精子質(zhì)量的影響

如表3所示，與對照組相比，20 mg/kg組精子總數(shù)、 各級精子活力及畸形率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)； 40 mg/kg組附睪精子總數(shù)、 a級活力精子、 精子活動率及畸形率(精子畸形情況見圖1)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05或p<0.01).

表3 Fen對附睪精子數(shù)量、 活力及畸形率的影響

圖1 Fen染毒后導(dǎo)致的精子畸形情況

2.3 Fen對雄性SD大鼠血清及睪丸E2水平的影響

如圖2所示，與對照組相比，20 mg/kg組血清和睪丸中E2水平均未顯著增加(p>0.05)； 40 mg/kg組血清和睪丸中E2水平均顯著升高(p<0.05，p<0.01)．提示Fen具有提升雄性體內(nèi)E2水平的作用，且這種作用隨Fen染毒劑量的增加而加強.

與對照組相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖2 Fen對血清及睪丸E2水平的影響

2.4 Fen對雄性SD大鼠睪丸CYP19A1和ERβ mRNA表達(dá)的影響

如圖3所示，與對照組相比，雄鼠睪丸CYP19A1和ERβ mRNA表達(dá)水平均隨染毒劑量增加而上調(diào)，CYP19A1 mRNA表達(dá)水平在20 mg/kg和40 mg/kg組均極顯著上調(diào)(p<0.01)； ERβ mRNA表達(dá)水平在20 mg/kg組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，在40 mg/kg組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)，提示Fen具有上調(diào)雄鼠睪丸CYP19A1和ERβ基因表達(dá)的作用.

與對照組相比，**表示p<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖3 Fen對雄性SD大鼠睪丸CYP19A1和ERβ mRNA表達(dá)的影響

2.5 Fen對雄性SD大鼠睪丸CYP19A1和ERβ蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對照組相比，雄鼠睪丸CYP19A1和ERβ蛋白表達(dá)水平均隨染毒劑量增加而增加，CYP19A1在20 mg/kg組和40 mg/kg組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05，p<0.01)； ERβ在20 mg/kg差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，在40 mg/kg組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)，提示Fen具有上調(diào)雄鼠睪丸CYP19A1和ERβ蛋白表達(dá)的作用.

與對照組相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖4 Fen對雄性SD大鼠睪丸CYP19A1和ERβ蛋白表達(dá)的影響

2.6 Fen對雄性SD大鼠睪丸Bax，Caspase 3，Caspase 9及Bcl-2 mRNA表達(dá)情況的影響

如圖5所示，與對照組相比，雄鼠睪丸Bax，Caspase 3及Caspase 9 mRNA表達(dá)水平均隨染毒劑量增加而上調(diào)，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平隨染毒劑量增加而下調(diào)，Bax，Caspase 3及Caspase 9 mRNA表達(dá)水平在40 mg/kg組均極顯著上調(diào)(p<0.01)，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平在20 mg/kg組顯著下調(diào)(p<0.05)，在40 mg/kg組極顯著下調(diào)(p<0.01).

與對照組相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖5 Fen對雄性SD大鼠睪丸Bax，Caspase 3，Caspase 9及Bcl-2 mRNA表達(dá)情況的影響

2.7 Fen對雄性SD大鼠睪丸Bax，Caspase 3，Caspase 9及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與對照組相比，雄鼠睪丸Bax，Caspase 3，Caspase 9蛋白表達(dá)水平均隨染毒劑量增加而上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平隨染毒劑量增加而下調(diào)，Caspase 3，Caspase 9及Bcl-2蛋白表達(dá)水平在40 mg/kg組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)； Bax蛋白表達(dá)水平在20 mg/kg和40 mg/kg組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05，p<0.01).

與對照組相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖6 Fen對雄性SD大鼠睪丸Bax，Caspase 3，Caspase 9及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

2.8 Fen對雄性SD大鼠睪丸曲細(xì)精管中生精細(xì)胞凋亡的影響

如圖7顯示，與對照組相比，F(xiàn)en染毒組雄鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡數(shù)量(1個視野中)增加，在40 mg/kg組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)，提示隨著Fen染毒劑量的增加，雄鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡逐漸增多.

藍(lán)色熒光為細(xì)胞核(DAPI染色)，綠色熒光為凋亡細(xì)胞(箭頭所示)．與對照組相比，**表示p<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖7 Fen對雄性SD大鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡情況的影響

2.9 Fen對雄性SD大鼠睪丸病理結(jié)構(gòu)的影響

如圖8所示，對照組大鼠曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)完整，生精細(xì)胞數(shù)量多，排列緊密； 20 mg/kg組大鼠睪丸曲細(xì)精管生精細(xì)胞數(shù)量減少，部分曲細(xì)精管出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的生精細(xì)胞缺失(箭頭所示)； 40 mg/kg組大鼠睪丸曲細(xì)精管生精細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，可見部分曲細(xì)精管生精細(xì)胞排列紊亂，生精細(xì)胞缺失嚴(yán)重，管腔內(nèi)精子較少.

圖8 Fen對睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)的影響

3 討 論

正常雄性生育能力的維持依賴于精子發(fā)生的有效進(jìn)行．正常有效的精子發(fā)生既有賴于睪丸中的生精細(xì)胞、 支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞之間的密切協(xié)調(diào)，又受到下丘腦-垂體-性腺軸的生殖內(nèi)分泌調(diào)控，同時這兩個方面之間還相互協(xié)調(diào)、 相互依存，彼此密不可分．在生殖內(nèi)分泌調(diào)控中，雄性精子發(fā)生主要受黃體生成素介導(dǎo)的睪酮分泌的調(diào)控，但雌激素在雄性精子發(fā)生過程中也同樣起著不可或缺的作用．研究顯示，適量的雌激素在雄性生殖中具有促進(jìn)精子發(fā)生、 抑制生殖細(xì)胞凋亡、 提高精子受精能力等作用[8-10]，而雄性體內(nèi)雌激素的含量過低或過高均會引起雄性精子發(fā)生異常以及生殖能力下降[11-12].

在藥理學(xué)和毒理學(xué)中，體質(zhì)量及臟器系數(shù)是一個關(guān)鍵的毒性觀察指標(biāo)．結(jié)果顯示，青春期雄性SD大鼠暴露于Fen后，大鼠的體質(zhì)量及附睪和睪丸的臟器系數(shù)均出現(xiàn)減小的趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，這表明本研究中Fen的劑量對雄鼠整體的生長情況并未產(chǎn)生太大的影響.

精子質(zhì)量是衡量雄性生殖能力的重要指標(biāo)[13]．在精子發(fā)生的過程中，各級生精細(xì)胞對有毒化學(xué)物質(zhì)的作用十分敏感，易受到有毒化學(xué)物質(zhì)的干擾而導(dǎo)致精子的數(shù)量減少和活力降低．本研究的結(jié)果表明，F(xiàn)en染毒后，各染毒組精子數(shù)量、 精子活力和精子活動率均較對照組降低，精子畸形率較對照組增加，且在40 mg/kg組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這與Zhang等[14]的研究結(jié)果一致．這說明Fen對雄性的生殖能力具有損害作用.

雌二醇(E2)是雄性體內(nèi)最主要的雌激素．本研究的結(jié)果表明，在Fen連續(xù)染毒30 d(兩個生精上皮周期)后，雄性大鼠血清和睪丸中E2含量均較對照組增高，并且在40 mg/kg組，二者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，這表明Fen可促進(jìn)雄性體內(nèi)E2的生成，提高雄鼠體內(nèi)雌激素的水平．Carreau等[11]研究發(fā)現(xiàn)，雄性睪丸中雌激素水平過高會引起雄性精子發(fā)生異常，使精子質(zhì)量降低，導(dǎo)致雄性生殖能力下降．這提示我們Fen可通過增加雄性睪丸中雌激素的水平而損害雄性生殖功能.

雄性體內(nèi)的E2由雄激素在睪丸中轉(zhuǎn)化而來，芳香化酶(CYP19A1)是這一轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵酶．CYP19A1在雄性睪丸間質(zhì)細(xì)胞、 生精細(xì)胞及精子中均有表達(dá)[15]．以往的研究發(fā)現(xiàn)，CYP19A1在雄性體內(nèi)低表達(dá)或過度表達(dá)均會引起雄性精子發(fā)生異常，使精子數(shù)量減少和活力降低，導(dǎo)致雄性生殖損傷甚至不育[6，12，16-18]，這主要與CYP19A1表達(dá)異常致使雄性睪丸內(nèi)E2合成不足或過量有關(guān)[11-12]．本研究中各染毒組睪丸CYP19A1的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組均顯著增加，這與Fen染毒后引起血清和睪丸中E2含量增加的研究結(jié)果相一致．這表明Fen是通過誘導(dǎo)睪丸中CYP19A1的表達(dá)，促進(jìn)雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，從而升高雄性睪丸中雌激素水平的.

雌激素發(fā)揮其生理作用需通過其特異性受體(雌激素受體，ERs)的介導(dǎo)．ERs屬于激素核受體超家族的成員，其主要包括ERα和ERβ兩種亞型，其中ERβ主要分布于成熟雄性大鼠的支持細(xì)胞和生精細(xì)胞[19，20]，對維持正常雄性生殖能力發(fā)揮著十分重要的作用．Delbes等[21]研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠ERβ可促進(jìn)小鼠生殖母細(xì)胞的增殖同時抑制其凋亡； Gould等[22]和Dumasis等[23]發(fā)現(xiàn)，ERβ受體激動劑可促進(jìn)生精細(xì)胞的凋亡．我們的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)en可誘導(dǎo)大鼠睪丸中ERβ的mRNA和蛋白高表達(dá)，并且40 mg/kg組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)．同時，我們還發(fā)現(xiàn)，隨著ERβ的表達(dá)量升高，雄性大鼠曲細(xì)精管發(fā)生凋亡的生精細(xì)胞比例也逐漸增加，這與Xie等[24]以及Qu等[25]用雙酚a、 全氟辛烷磺酸等其他環(huán)境內(nèi)分泌干擾物研究的結(jié)果相一致．這些結(jié)果提示我們，F(xiàn)en可能通過誘導(dǎo)雄鼠睪丸中ERβ的表達(dá)，過度增強ERβ信號作用，而促進(jìn)生精細(xì)胞的凋亡，使曲細(xì)精管中生精細(xì)胞數(shù)量和管腔內(nèi)精子數(shù)量減少，但ERβ引起生精細(xì)胞凋亡的機制尚不清楚.

線粒體凋亡途徑是細(xì)胞最重要的凋亡途徑之一，在各種外源性病理刺激條件下，Bcl-2家族中的促凋亡蛋白(如Bax，Bad等)發(fā)生去磷酸化，與線粒體膜上的抗凋亡蛋白(如Bcl-2，Bcl-XL等)結(jié)合，而開啟線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔，導(dǎo)致凋亡相關(guān)因子，如細(xì)胞色素C、 凋亡誘導(dǎo)因子等從線粒體內(nèi)釋放進(jìn)入胞漿，激活Caspase家族的凋亡啟動者Caspase 9，Caspase 9激活后能引起Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終激活凋亡執(zhí)行者Caspase 3，而引起細(xì)胞凋亡[26-28]．我們的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)en染毒上調(diào)了大鼠睪丸中促凋亡基因Bax，Caspase 3及Caspase 9 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，同時抑制了抗凋亡基因Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)．這些結(jié)果似乎提示我們，F(xiàn)en誘導(dǎo)的雄鼠睪丸ERβ過度升高可能與線粒體凋亡途徑的激活之間存在著某種聯(lián)系，但具體機制還有待進(jìn)一步研究.

綜上所述，我們猜測Fen通過上調(diào)雄性大鼠睪丸中CYP19A1和ERβ的表達(dá)，致使睪丸E2水平升高的同時，又過度增強E2-ERβ信號作用，后者通過某種機制激活線粒體凋亡途徑，從而引起生殖細(xì)胞的過度凋亡，精子發(fā)生異常，精子數(shù)量和活力降低，畸形精子增多，最終導(dǎo)致雄性大鼠的生殖損傷．然而Fen是通過何種機制上調(diào)雄性大鼠睪丸中CYP19A1和ERβ的表達(dá)水平以及ERβ的高表達(dá)是否與生殖細(xì)胞線粒體凋亡途徑的激活有關(guān)，這些問題都還有待今后進(jìn)一步明確.